C1抑制物基因突变提前形成终止密码子导致遗传性血管水肿

徐迎阳，支玉香

(中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院变态反应科，北京 100730)

ChinJAllergyClinImmunol,2013,7(2)：125-128

遗传性血管性水肿(hereditary angioedema, HAE)是一种较少见的常染色体显性遗传病，其发生率约为1∶50 000～1∶10 000[1-2]，主要表现为反复性皮下或黏膜下水肿[3]。HAE可累及身体任何部位，其中以四肢、颜面、生殖器及消化道和呼吸道黏膜较为常见[3]。因呼吸道黏膜水肿存在可致快速呼吸困难或窒息的潜在风险而被认为是一种危及生命的急性水肿发作，死亡率可达30%～40%[4-5]，严重影响患者生命，因此受到国内外学者的高度关注。目前将HAE分为3种亚型[6]。传统上认为HAE即C1抑制物(C1 inhibitor，C1 INH)缺乏症，由于C1 INH编码基因突变导致该蛋白产物功能缺陷所引起，即1型和2型HAE。3型HAE与C1 INH基因突变无关，目前研究结果多显示此亚型发病与凝血因子FⅫ编码基因突变有关[7-8]。

迄今为止，国内外已报道的与HAE发病相关的C1 INH基因突变多达两百余种[9]，具有很大的异质性。除最近对中国HAE患者进行较大样本的C1 INH基因突变报道外[10]，其余仅见少数单个家系报道[11-12]。本文对2011至2012年北京协和医院7例来自不同HAE家系的先证者进行基因突变分析，丰富中国HAE患者C1 INH基因突变数据库。

对象和方法

对象

2011至2012年北京协和医院变态反应科诊断为Ⅰ型HAE来自不同HAE家系的先证者7例。诊断标准为反复发作的皮肤和或黏膜水肿，伴补体C4浓度降低、C1 INH浓度及功能降低，而C1q正常。另于2012年由北京协和医院体检中心募集53名健康成人为对照组，补体筛查C4浓度及C1 INH水平均正常，且无HAE家族史。本研究获得北京协和医院伦理委员会批准，每名受试者均签署知情同意书。

基因分析方法及试剂

分别采集HAE患者及对照组外周静脉血2 ml，置EDTA抗凝管中。盐析法提取外周血基因组DNA，分光光度计测量光密度(Optical Density，OD)260及280值。根据GenBank中C1 INH参考序列X54486，设计C1 INH基因8个外显子的扩增引物。聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)反应体系50 μl(10×PCR缓冲液5 μl，MgSO43 μl，dNTP 8 μl，正向反向引物各1 μl，FastStar Taq 0.5 μl，模板DNA 2 μl，ddH2O 28.5 μl)。PCR反应条件：95℃预变性2 min；95℃变性30 s，51～60℃退火1 min，72℃延伸30 s，循环40次；72℃，10 min。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，送华大基因测序。

测序结果与标准核苷酸序列X54486 (BA123456，GenBank)进行比对以鉴定突变。核苷酸计数包括2种方法：(1)以第一外显子上第一个核苷酸计为+1；(2)根据人类基因组突变协会(Human Genome Variation Society, HGVS)推荐以编码序列(coding sequence, CDS)上翻译起始密码子ATG的A计为CDS+1。氨基酸计数以包含信号肽的未成熟蛋白的第一个氨基酸残基Met为+1。

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP) 检测：序列比对后，DNA序列上发生的单个核苷酸碱基的变异，在人群中(包括健康对照和患者)这种变异的发生频率大于1%者，鉴定为SNP。

结　　果

C1 INH基因突变

7例HAE先证者C1 INH基因中共发现7种不同突变，3种无义突变和4种移码突变(表1)。测序图见图1。对照组中均无以上改变。

SNP检测

7种SNP分别是g.1965 G>A，g.3248T>C，g.3493T>C，g.5755 G>A，g.9498 T>C，g.15193 A>G，g.18012 G>A(表2)。其中g.1965 G>A，g.5755 G>A，g.9498 T>C既往未见报道，已由笔者提交至寡核苷酸多态性数据库(database of SNP，dbSNP)数据库，并获得检索序号。

讨　　论

C1 INH是目前已知活化C1r和C1s的唯一抑制物，并通过这一抑制作用阻止补体经典途径激活。在接触系统中C1 INH能够抑制激肽释放酶原活化及激肽释放酶和FⅫa的全部活性。激肽释放酶原、激肽释放酶及FⅫa是参与缓激肽合成级联反应的主要蛋白。因此，C1 INH缺陷会引起缓激肽合成级联反应过分激活，产生过量缓激肽，后者通过增加血管壁的通透性，导致水肿发生[13-16]。C1 INH由9个α-螺旋、3个β-折叠和1个反应环(reactive central loop，RCL)构成，RCL是C1 INH与靶蛋白酶相互作用部位，故RCL是C1 INH发挥功能的关键结构[17]。C1 INH缺陷使其对靶蛋白酶抑制作用减弱，导致靶酶活性增高，使得补体系统过度活化，表现为C4浓度降低，接触系统则表现为激肽释放酶活化增强以及缓激肽生成增多，最终导致血管性水肿的发生。

表1　C1抑制物基因突变检测结果

HUGO：国际人类基因组组织；CDS：编码序列；exon：外显子

表2　C1抑制物基因单核苷酸多态性检测结果

HUGO：国际人类基因组组织；CDS：编码序列；exon：外显子；intron：内含子；*由本文作者提交至寡核苷酸多态性数据库

C1 INH基因位于11号染色体q11-q13.1，含有8个外显子和7个内含子[18]，典型的HAE(1型和2型)是由于C1 INH基因突变导致编码蛋白量的缺乏或功能缺陷所致。此前一项针对48例HAE患者进行的C1 INH基因突变研究发现了34种不同突变，初步建立了我国C1 INH突变数据库[10]。本研究对7例Ⅰ型HAE患者进行突变筛查，共鉴定7种突变，其中突变c.289 C

突变c.44 delT、c.939 delT、c.1214-1223 delCCAGCCAGGA及c.1279 delC因出现缺失数量非3整数倍的碱基缺失使编码框发生移位，并分别在其下游序列形成终止密码子。以上4种移码突变所形成终止子分别位于氨基酸序列第78、320、427和428位，均位于反应键第466位Arg上游，故其蛋白产物同样不包括RCL，导致C1 INH蛋白无功能而引发HAE。除c.1279 delC曾有报道[10]外，c.44 delT、c.939 delT及c.1214-1223 delCCAGCCAGGA均为首次报道。

此外，本研究在HAE患者及对照组中共检测到7种SNP。其中g.2066T>C、g.2311 T>C、g.14011 A>G及g.16830 G>A已被HapMap数据库收录。g.738 G>A、g.4573 G>A及g.8316 T>C已由笔者提交至dbSNP, 并获得检索号(rs199473715、rs11229063及rs141593943)。

综上所述，本研究对7例HAE患者进行C1 INH基因序列分析，共鉴定7种不同的C1 INH基因突变，其中5种为国内外首次报道，丰富了中国C1 INH基因突变数据库。希望通过对C1 INH进行基因检测，为HAE家系成员提供遗传咨询，且为尚未发病及表现不典型的HAE患者的诊断提供帮助。

(本文图1见封2)

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