核酸适配体在病毒检测中的研究进展

李敏思，伏小平，宋战昀，付志金

（1.甘肃农业大学，甘肃 兰州 730070；2.吉林出入境检验检疫局；吉林 长春 130062；3.吉林农业大学，吉林 长春 130118）

20世纪90年代指数富集配体系统进化技术（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）由Tuerk C和Gold L首次提出，此后核酸的研究进入了新阶段[1]。近年来，随着SELEX技术的不断完善，使得人们意识到DNA和RNA除了具有遗传信息存储和传递功能之外，在一定条件下可以凭借自身折叠形成的特定空间结构与其他分子发生相互作用并且能够发挥出超常的作用。利用该技术从特定的寡核苷酸库中筛选出与目标靶有特异性相互作用的寡核苷酸配体叫做适配体（aptamer）。适配体具有体外人工合成，不受免疫原性和免疫条件限制，变性与复性可逆，可定量检测，高特异性，高亲和力等特点。SELEX技术发展至今，已经筛选到的病毒相关适配体主要包括人类免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus，HIV）的表面蛋白，肝炎病毒表面抗原、非结构蛋白酶和核心抗原，流感病毒血凝素，严重急性呼吸综合症（Severe acute respiratory syndromes，SARS）病毒的解旋酶适配体等。目前，SELEX技术已经广泛地应用到各项研究领域当中，在病毒研究中表明适配体能够识别和结合到病毒的特定部位，适配体可以作为功能阻断剂从而影响病毒的复制、翻译等步骤，从而阻止疾病的发生，也可特异性的识别被病毒感染的细胞，从而用于诊断，同样可以替代抗体的特定功能，从而用于治疗。本文主要针对SELEX技术在病毒核酸适配体检测方面的最新研究进展做如下综述。

1 人类免疫缺陷病毒

人类免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus，HIV）是一种潜伏期极长的逆转录病毒，属于慢病毒属。随着对HIV感染的深入研究以及核酸适配体筛选技术的发展，针对HIV表面蛋白已经筛选出可以与HIV具有特异性并且高亲和性结合的适配体，HIV表面蛋白包括调控蛋白Tat、结构蛋白RT、结构蛋白gp120，还筛选出来了抗原P24的适配体。由于体外培养病毒较困难，快速检测病毒方法不多，生物传感器方法不仅灵敏度高，而且可以在实际样品实现快速检测用于疾病的早期诊断和治疗，因此利用这些适配体传感器成为快速检测病毒的一种新的手段。Rahim Ruslinda A等[2]首次利用金刚石场效应晶体管（field effect transistor，FET）作为RNA适配体传感元件用来检测实际样本中的HIV Tat蛋白，根据Tat蛋白浓度变化与适配体结合所引起信号强弱变化进行检测HIV－1病毒，结果第一次证明了利用实际样本中的HIV Tat蛋白的浓度可下降到1nmol／L。Liang Yu等[3]设计了HIV逆转录酶（reverse transcriptase，RT）适配体信标93del5dMB，在用1μmol／L的适配体的信标中，有效的荧光信号随着HIV RT的浓度从0.5μmol／L～5μmol／L增加而增加，当信标被传递到适配体的活细胞中时HIV RT瞬时表达，HIV RT可特异性标识和成像，试验证明该方法可应用于艾滋病的HIV RT在活细胞中的完整成像。张宁等[4]利用SELEX技术以重组P24为靶标筛选到能与HIV－P24特异性结合的两条核酸适配体，为HIV诊断和治疗提供了试验基础。Joshi R等[5]以HIV RT为靶分子，经SELEX技术筛选出能够特异性结合HIV RT的RNA适体。结果显示，该适配体在体外和细胞培养中都能使病毒的复制减少90%～99%，能够成功阻断了HIV的逆转录过程，从而有效地抑制病毒感染，并且对HIV抗药亚型同样有较强的抑制作用，该试验为HIV的基因治疗提供了高效的方法。入侵宿主细胞的主要物质是其表面的糖蛋白gp120和gp41。因此，目前研制针对HIV表面糖蛋白或者其受体以阻止HIV核心进入细胞的药物是当前热点问题[6]。Khati等对变异株病毒gp120部分保守区域筛选得到的2＇F－RNA型适配体能特异结合gp120，并能够抑制HIV感染者外周血单核细胞的活性提高1000倍，其抑制活性不依赖于CD14与gp120的结合，为治疗HIV奠定了新的基础，该方法有望成为新一代治疗HIV的药物[7]通过利用筛选出来的核酸适配体与HIV高效特异的结合，综合利用适配体传感器、分子信标等方法，为HIV的高效诊断，基因治疗，新药研发奠定了基础。

2 肝炎病毒

肝炎病毒是引起病毒性肝炎的病原体。目前，针对甲、乙、丙型肝炎，已经筛选出以核心蛋白、3C蛋白酶、囊膜糖蛋白E2、NS3螺旋酶为靶标的核酸适配体，其中丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）是一种具有脂质囊膜的RNA病毒，核心蛋白在HCV感染1周后就会出现在血液中，因此，HCV核心蛋白适用于HCV窗口期检测。针对肝炎病毒的早期检测，张震等[8]建立了具有高灵敏度检测HCV核心蛋白的核酸适配体－酶联免疫方法，并且能够成功的检测出丙型肝炎病人血清中的核心蛋白，为丙型肝炎血清临床诊断提供了快捷灵敏方便和低成本的新方法，打破了过去酶联免疫方法不适合早期检测 HCV的观点。Chen Fang等[9]针对HCV活病毒进行筛选，得到了靶向HCV包膜糖蛋白E2的适配体，可作为针对HCV患者的诊断试剂。Liu Jia等[10]在感染乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）的干细胞上面发现了HBV表面抗原（HBsAg），荧光标记适配体靶目标 HBsAg A22，荧光显微镜观察抗HBsAg结合到阳性细胞中，并且不与阴性细胞结合。结果证明，该方法可用于荧光适配体成像，首次证实了HBV特异性抗原适配体可用于HBV早期诊断和治疗。针对抑制病毒的复制方面，Kikuchi K等[11]筛选出针对HCV的IRES区域Ⅱ的适配体，由于IRES对mRNA的转录非常重要，该适配体可以通过影响病毒的转录，从而抑制病毒的复制能力。詹林盛等[12]筛选出了与HCV NS3螺旋酶特异结合的寡核苷酸适配体，发现适配体在体外对HCV NS3的活性抑制达44%。针对研发相关药物对肝炎的治疗方面，柏文娟等[13]利用SELEX技术筛选出获得性结合患者血清IgG抗体的特异性适体，结果显示纯化获得的IgG抗体浓度为1.3mg／mL，对亲和性吸光度值大于1.0的4个适体分析其中有3个适体对结核病组与健康对照组的检测结果具有显著差异，说明初步筛选获得结核患者血清IgG抗体的适体有较高的特异性。Blaum B S等[14]使用1HNMR光谱从G－四链体中发现六核苷酸（G5T）可被视为最小的适配体，并特异性结合甲型肝炎病毒（Hepatitis A virus，HAV）3C蛋白酶，研究表明，特异性序列核酸蛋白与六核苷酸相互作用，这些复合物可能具有治疗HAV的药物相关性。

3 流感病毒

流感病毒是一种能够造成人类及动物患流行性感冒的RNA病毒。目前已经针对人类流感病毒和禽流感病毒筛选出了相应的适配体，其中流感病毒表面血凝素（hemagglutinin，HA）蛋白是流感病毒最重要的抗原成分，同样，也是抗体重要的结合位点，介导着病毒的初期感染。在抑制流感病毒感染方面，Subash C B等[15]筛选到了人类A型流感病毒RNA适配体，特异性结合H3N2HA，该适配体与HA蛋白的亲和力比相应的单克隆抗体高了15倍，能够有效地抑制HA介导的膜融合，并且能够鉴定不同亚型的A型流感病毒。Cheng Congsheng等[16]以H5N1的 HA蛋白为靶物质，成功筛选到DNA适配体，该适配体具有特异性结合病毒HA蛋白的能力，同时可以有效抑制H5N1亚型流感病毒感染MDCK细胞，可以有效延缓病毒感染机体。在利用生物传感器方面，Liu Xianggang等[17]基于DNA适配体和纳米材料修饰电极构建了电化学生物传感器，成功用于检测H5N1基因序列，检测范围5.0×10－12～1.0×10－9M，检测限为4.3×10－13M。Wang Ronghui等[18]成功建立了水凝胶QCM传感器用于检测H5N1禽流感病毒，利用3种不同比例的水凝胶涂与传感器上检测H5N1禽流感病毒，结果显示比例为1∶1的水凝胶检测限为0.0128HAU（HA unit），从抽样到检测的时间为30min，证实了水凝胶QCM传感器较抗体明显降低了检测限和检测时间。在流感病毒药物研发方面，Park S Y等[19]利用SELEX技术成功筛选出针对A型流感病毒H5亚型HA蛋白的RNA适配体HAS15－5，结合血凝抑制试验，结果显示出该适配体具有抑制病毒HA受体结合域的作用，具有开发针对H5亚型禽流感病毒药物的潜能。

4 SARS病毒

SARS病毒是一种能够快速传播并且具有高传染性的冠状病毒，目前针对SARS病毒的核衣壳蛋白、N蛋白、NTPase解旋酶等为靶标已经成功筛选出了适配体并且应用于抑制病毒复制、病毒检测和治疗等方面研究。在病毒检测方面，Cho S J等[20]以SARS病毒核衣壳蛋白作为筛选靶物质，成功构建DNA文库，结合ELISA与Western blot进行分析鉴定，结果核衣壳蛋白的Kd值为4.93nmol／L±0.30nmol／L，证明了该单链DNA适配体能够更有效地检测SARS病毒核衣壳蛋白。Ahn D G等[21]筛选到了SARS病毒N蛋白的RNA适配体，该适配体能特异性结合N蛋白羧基末端，利用该适配体捕获抗原，建立了检测SARS病毒N蛋白适配体－抗体免疫测定方法，检测结果为SARS病毒N蛋白最低限浓度为2pg／mL，因此提出并建立了适配体－抗体免疫测定法能够特异、敏感的检测SARS病毒。在抑制病毒复制方面，Jang K J等[22]针对SARS病毒NTPase解旋酶为靶标，利用SELEX技术筛选得到主要位于二级结构环区内的含有10个～11个核苷酸的保守序列（AAAGGR（G）GAAG；R，嘌呤碱）RNA适配体，此RNA适配体抑制双链DNA解旋酶活性的能力提高了85%，由于解旋酶是病毒复制所必须的酶，抑制了解旋酶的活性就能有效抑制SARS病毒的感染。Shum K To等[23]也针对SARS病毒解旋酶筛选到了2种构型的DNA适配体，其中G－四分体的适配体对解旋酶没有抑制作用，而非G－四分体适配体能特异性抑制解旋酶的活性。因此，适配体与病毒的活性酶在一定的空间结构结合后就能在一定程度上抑制该酶的活性，从而抑制病毒复制，为病毒病治疗提供了一条新的途径。

5 其他

核酸适配体发展至今，适配体可以被用于治疗任何由有害基因的表达而引起的疾病，利用不同的筛选技术已针对广泛类型的病毒筛选出相应的病毒适配体。例如，Bruno J G等[24]利用筛选到的针对口蹄疫病毒VP1特异性适配体，建立了检测口蹄疫病毒的定量竞争性荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfe，FRET）方法，该方法可以在10min内定量检测到脏器25ng／mL～250ng／mL的口蹄疫病毒，这种定量检测方法能快速、敏感、特异的检测口蹄疫病毒。Murakami K等[25]以牛的朊病毒蛋白质作为筛选靶物质，体外构建了RNA富集文库，结果显示通过蛋白质印迹法证明适配体可以在牛脑组织匀浆中特异性的结合朊病毒蛋白，证实了该适配体可以应用于朊病毒蛋白的检测，能够有效地诊断朊病毒感染。Ellenbecker M等[26]利用SELEX获得了具有高亲和力的裂谷热病毒核衣壳蛋白的RNA适配体，成功构建荧光生物传感器，结果显示该生物传感器可以用来检测抗病毒药物的筛选。梁红茹等[27]通过SELEX技术筛选出以狂犬病病毒感染的BHK－21为靶标的5个单股DNA适配体，通过病毒滴度和实时荧光定量PCR表明5个适配体均能在细胞水平上抑制狂犬病病毒的增殖，并且T14和F34抑制效果最明显，在一定范围内，适配体浓度越高，抑制病毒增殖效果越明显，因此证实筛选出来的适配体可以抑制狂犬病病毒增殖，具有抗病毒治疗的应用前景。根据上述可知，适配体在病毒诊断和治疗方面具有广泛的应用潜能，基于核酸适配体在病毒研究领域中的新技术具有良好的发展前景，越来越多的病毒核酸适配体将会被筛选。

6 小结与展望

核酸适配体在病毒检测研究领域已经取得了一些研究成果，这些成果有优良的特性和乐观的应用前景。但是仍有许多不足之处，例如，核酸适配体制备昂贵并且不稳定，很难独立接近和穿透靶组织等系列问题。尽管现阶段还没有适配体毒副作用的报道，但是其安全性还有待证明，经体外筛选获得的核酸适配体可能在体内试验会失效，如何增加稳定性、降低成本、加强靶向性，将是适配体在检测中的主要挑战。经研究发现降低适配体结构的柔性，提高热稳定性是核酸适配体具有体内活性的必要条件。一些专家认为锁定核酸（locked nucleic acid，LNA）具有良好的热力学稳定性，现已成为研究的热点[28]。目前，适配体和筛选方法作为检测研究仍处于发展阶段，但随着适配体筛选技术和方法的不断发展和完善，适配体的应用范围将不断拓展，核酸适配体作为检测应用，将在检测领域发挥更大的作用。越来越多的研究结果显示，适配体以独特的特性和SEL－EX过程的多样化，相信其不久就可代替抗体适用于疾病的诊断和治疗。

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