柔嫩艾美耳球虫Sir2基因的注释、克隆与原核表达

鄢远会，戚南山，廖申权，李 娟，吴彩艳，吕敏娜，孙铭飞＊，杨亮宇

（1.云南农业大学动物科学技术学院，云南 昆明 650201；2.广东省农业科学院动物卫生研究所，广东 广州 510640）

鸡球虫病是一种全球流行且严重危害养鸡业生产的重要寄生虫病，目前仍主要依赖各种抗球虫药物进行防治，但由于广泛产生的球虫抗药性问题，急需新的抗球虫药物出现[1]。

沉默信息调节因子2（Sir2）是广泛存在于从古细菌到人类的多种生物细胞中，具有依赖NAD＋的去乙酰化酶活性和ADP－核糖转移酶活性的一类组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylases，HDACs）[2]。研究表明，Sir2参与调节染色质结构，影响细胞的衰老，在染色质沉默、姐妹染色单体调聚、基因调控、代谢调节和抑制细胞凋亡等一系列细胞生物活动过程中起重要作用[3－6]。O－acetyl－ADP－ribose（OAADPr）是Sir2调节去乙酰化反应的产物之一，OAADPr被证实能阻止或延迟海星胚胎的细胞分裂，研究证实通过刺激Sir2p／Sir3p／Sir4p复合物的形成可导致酵母重要功能基因沉默[3]。近年来，在恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）、克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）、刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）、犬新孢子虫（Neospora caninum）和利什曼原虫（Leishmaniaspp）等寄生虫中也相继发现Sir2蛋白，并发现其在寄生虫抗原变异、端粒沉默和DNA修复等生理过程中发挥重要作用[3，7－8]。鉴于低等生物与其宿主在 Sir2基因序列和蛋白结构上的差异，近年来被作为抗病原微生物药物靶标成为了研究的热点，并以此为靶标，已筛选获得了一系列具有抗P.falciparum活性的先导化合物[9－12]。

但目前尚未见艾美耳球虫沉默信息调节因子2蛋白（EtSir2）功能、编码基因研究的报道。鉴于此，本研究拟以对鸡危害最为严重的柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）为研究对象，通过电子克隆策略注释其基因序列，并进行克隆以及重组表达，为进一步研究EtSir2的功能，以及以其为靶标筛选新型抗球虫药物奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 虫株 E.tenella（Houghton株）第2代裂殖子cDNA文库由广东省农业科学院兽医研究所寄生生物学研究室制备并保存。

1.1.2 菌株和载体 E.coli DH5α、E.coli JM109以及E.coli Rosetta菌株均由广东省农业科学院兽医研究所寄生生物学研究室保存；pMD18－T Vector和pET43a载体购于宝生物工程（大连）有限公司。

1.1.3 试剂 乙二胺四乙酸（EDTA）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、氨苄青霉素（Amp）、异丙基－β－D－硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）、十二烷基硫酸钠（SDS）、溴化乙锭（EB）、溴酚兰为上海生工生物工程技术服务有限公司产品；DNA Marker DL 2000（MD114）为天根生化科技（北京）有限公司产品；琼脂糖和RTPCR试剂盒为宝生物工程（大连）有限公司产品；E.Z.N.A.质粒小量制备试剂盒和DNA胶回收试剂盒为奥美德诺（北京）基因科技有限公司产品；2×Taq PCR MasterMix为天根生化科技（北京）有限公司产品；TaKaRa LA TaqTM为TaKaRa公司产品。T4DNA连接酶、限制性内切酶为上海生工生物工程技术服务有限公司产品。750mL／L乙醇溶液，用无核酶水依试验中所需的量现配制；磷酸盐缓冲液（PBS），TAE核酸电泳缓冲液：参照《分子克隆实验指南》配制。

1.1.4 培养基 LB液体培养基，LB琼脂培养基，SOC液体培养基，参照《分子克隆实验指南》配制。

1.1.5 引物

1.1.5.1 克隆Sir2基因所需引物 根据注释的E.tenella Sir2基因序列，采用Premier Primer 6.0软件设计需要合成的引物，由invitrogen公司合成：

上游引物Sir2F：5′－ATGTGCACGCCGCACACAATC－3′

下游引物Sir2R：5′－TCATTCATTTTCCCCTGGGGGT－3′

1.1.5.2 表达系统的构建所需引物 上游引物：Sir2eF： 5′－GGCGAATTCATGGGCCAGTGGTTAACATACATGCG－3′，下游引物：Sir2eR：5′－GGCGTCGACTCATTCATTTTCCCCTGGGGGT TC－3′。

1.2 方法

1.2.1 Et Sir2基因注释 在NCBI和相关生物学网站（http：／／www.toxodb.org ，http：／／plasmodb.org／）搜索与E.tenella进化关系较近物种P.falciparum和T.gondii Sir2的基因序列，利用在线工具ClustalW 进行多重序列比对分（http：／／www.ebi.ac.uk／tools／clustalW），找到相对保守的氨基酸序列。利用保守的氨基酸序列作为种子序列，搜索球虫基因数据库 www.sanger.ac.uk／Projects／E tenella／，预测拼接Et Sir2基因序列。

1.2.2 PCR扩增Sir2全长ORF序列 以cDNA文库为模板，Sir2F，Sir2R 为引物，TaKaRa LA TaqTM酶进行PCR扩增，反应条件：94℃5min；94℃30s，60℃80s，72℃1min，循环35次；72℃延伸10min，退火温度设定为每循环降低0.2℃。将PCR产物切胶回收后连接至pMD18－T载体，再将连接产物转化入E.coli JM109克隆菌。挑取单菌落若干个，进行菌落PCR鉴定，阳性菌送华大基因公司测序。

1.2.3 序列分析 利用在线翻译工具对序列进行分析。用在线工 具 SignalP 4.1Server（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／SignalP／）进行信号肽序列分析，利用 TargetP 1.1Server（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／TargetP／）对Sir2进行亚细胞定位预测；利用在线工具TMHMM Server v.2.0（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／TMHMM／）进行跨膜结构域分析；利用在线工具ClustaiW2（http：／／www.ebi.ac.uk／Tools／msa／clustalw2／）进行多重序列比对分析。ESyPred3DWeb Server 1.0（http：／／www.fundp.ac.be／sciences／biologie／urbm／bioinfo／esypred／）结合软件SPDBV 4.10，模拟得出3D空间构象。

1.2.4 原核表达载体的构建 以上述测序正确的重组菌为模板，用Sir2eF和Sir2eR引物进行PCR扩增。将PCR回收产物及pET43a质粒分别于37℃恒温下用SalⅠ和EcoRⅠ双酶切3h，酶切产物电泳鉴定。将回收的酶切产物于4℃连接过夜，转化至E.coli DH5α感受态细胞，以Amp平板上的白色菌落为模板，进行PCR鉴定筛选。对PCR阳性克隆进行质粒提取，双酶切鉴定。将鉴定结果正确的菌送华大基因公司测序。

将测序正确的菌提质粒，转化至E.coli Rosseta菌，以Amp平板上的白色菌落为模板，进行PCR筛选。

1.2.5 诱导表达与蛋白纯化 将构建的表达菌于37℃摇振培养，180r／min，当OD600nm值为0.5时，加入IPTG至终浓度为1mmol／L诱导表达，转移至16℃摇床160r／min培养18h。3500r／min离心收集沉淀，加入细胞裂解液重悬后进行细胞超声裂解，9000r／min高速离心并分别收集上清和沉淀，经SDS－PAGE检测目的蛋白的表达水平及可溶性。取上清溶液，借助AKTA purifier蛋白纯化系统与Ni－NAT亲和层析柱使目的蛋白得到分离。

2 结果

2.1 Et Sir2基因注释结果

以比对的保守氨基酸序列为种子探针，对E.tenella基因数据库进行Omin Blast分析，结果显示EIMER－contig－00030494包括编码 Et Sir2的基因序列，以 MacVector11.0为工具进行分析，获得Et Sir2完整编码序列。ORF为1029bp，编码342个氨基酸，其编码的蛋白质分子质量为38ku左右。

2.2 PCR扩增EtSir2全长ORF序列

以EtHoughton第2代裂殖子cDNA文库为模板，用Sir2F和Sir2R引物首次扩增得到EtSir2预测序列，采用10g／L琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示扩增获得一条约1200bp的片段（图1）。

图1 EtSir2基因的PCR扩增产物凝胶电泳分析Fig.1 Electrophoresis analysis of PCR products of EtSir2gene

2.3 Sir2序列分析

利用在线工具进行信号肽、细胞亚定位以及跨膜结构域分析，结果显示EtSir2无信号肽序列，没有明确的亚细胞定位，不含有跨膜结构域。

利用在线工具ClustaiW2将EtSir2分别与刚地弓形虫（T.gondii）、恶性疟原虫（P.falciparum）、间日疟原虫（P.vivax）、猴疟原虫（P.cynomolgi）、约氏疟原虫（P.yoelii）、犬新孢子虫（N.caninum）、诺 氏 疟 原 虫 （P.knowlesi）、伯 氏 疟 原 虫 （P.berghei）、夏氏疟原虫（P.chabaudi chabaudi）、原鸡（Gallus gallus）以及人类（Homo sapiens）进行多重序列比对分析，结果显示这些基因所编码的氨基酸序列具有一定的相似性，各物种之间的相似性在24%～58%之间；构建的分子进化树显示，EtSir2与T.gondii和N.caninum处于同一进化支上，进化关系最为接近（图2）。

图2 不同物种Sir2种系进化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of Sir2sfrom different species

利用ESyPred3DWeb Server 1.0在线软件对EtSir2进行三维结构预测，结合软件SPDBV 4.10，模拟得出3D空间构象。预测EtSir2蛋白分为大小两个亚基，存在NAD＋及Zn2＋的保守结合位点。α－螺旋（α－helix）所占的比例较高为28.8%，扩展链（Extended strand）的比例为20.2%，无规卷曲（Random coil）的比例为51%，三者交替分布形成EtSir2蛋白的二级结构，如图3。

图3 预测的EtSir2三级结构Fig.3 Predicted tertiary structure of EtSir2

2.4 原核表达载体的构建

2.4.1 EtSir2的PCR扩增 以测序正确的克隆菌为模板，用Sir2eF和Sir2eR引物进行PCR扩增，采用10g／L琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示扩增获得一条约900bp的片段（图4）。

2.4.2 重组表达质粒的双酶切鉴定 对PCR鉴定的阳性克隆菌进行质粒提取，进一步双酶切鉴定重组质粒（图5）。鉴定结果正确的重组质粒送广东英俊公司进行测序。

图4 EtSir2基因序列的PCR扩增产物电泳分析Fig.4 Electrophoresis analysis of PCR Products of EtSir2gene

图5 pET43a－EtSir2的酶切鉴定Fig.5 Identification of pET43a－EtSir2by enzyme digestion

2.5 诱导表达与蛋白纯化

将构建好的pET43a－EtSir2转化至E.coli Rosseta（DE3），37℃培养至OD值0.5时加入IPTG至终浓度为1mmol／L诱导表达，转移至16℃摇床160r／min培养18h。将收集菌体重悬于细胞裂解液，在260W功率下超声裂解15min。高速离心分离上清和沉淀，经SDS－PAGE检测目的蛋白的表达水平及可溶性，重组表达的蛋白大小约99ku，与预期一致（图6）。

破碎细胞上清液通过Ni亲和层析方法使目的蛋白得到分离（图7）。

图6 pET43a－EtSir2表达产物SDS－PAGE分析Fig.6 SDS－PAGE analysis of pET43a－EtSir2expressed in E.coli

3 讨论

图7 EtSir2蛋白的Ni－NTA纯化Fig.7 Purification of EtSir2with Ni－NTA

组蛋白乙酰基转移酶和组蛋白去乙酰化酶（HDACs）调节组蛋白的乙酰化状态，调控转录、DNA复制和修复的一类蛋白酶，广泛存在于各类生物种[2]。目前依据其生化特性被分为三类，ClassⅠ和ClassⅡ类是依赖于Zn的去乙酰化酶，而ClassⅢ类则是依赖于辅酶NAD＋，本文所研究的EtSir2为ClassⅢHDACs，Sir2首先在酵母中被发现，是一种依赖NAD＋的去乙酰化酶，广泛存在于古细菌到人类的多种生物细胞中[3，13]。早期，在哺乳动物细胞培养过程中，研究人员发现SIRT2作用于H4K16，H4K16去乙酰化是细胞进入分裂期所必需。此外，North等发现，人SIRT2催化tublin和乙酰CoA合成酶的去乙酰化，提示其参与细胞内物质运输、吞噬和有丝分裂过程[13]。随后研究表明，SIR2参与了肿瘤细胞增殖的调控和细胞转化，可能作为肿瘤抑制因子维持着细胞的正常形态[14]。蜜蜂表达分析研究表明可能参与蜂王表型的调控[15]。近年来，在P.falciparum、T.cruzi和利Leishmania spp等寄生虫中也相继发现Sir2蛋白，并证实是P.falciparum重要的毒力因子[7－8]。由于这类寄生虫的Sir2在蛋白结构上与其宿主具有明显差异，也作为抗寄生虫药物研究的重要靶标成为了研究的热点。

近年来由于抗鸡球虫药物的长期使用，产生了广泛而严重的耐药性，急需新的抗球虫药物出现[16]。鉴于此，本研究对E.tenella基因组数据库进行分析，注释拼接了E.tenella Sir2基因序列，开放阅读框（ORF）为全长909bp，并成功克隆获得EtSir2的全长ORF基因序列。编码氨基酸序列与低等生物具有较高的相似性（42%～58%），说明寄生性原虫拥有保守的Sir2序列，而与高等生物人和鸡的氨基酸序列相似性仅有24%～25%。构建的分子进化树也显示，Et－Sir2与顶复门原虫T.gondii和N.caninum处于同一进化支上，而与高等生物进化关系最远，说明EtSir2在蛋白结构上与其宿主具有明显差异，提示可作为抗寄生虫药物研究的重要靶标。对EtSir2进行在线工具分析，结果显示EtSir2无信号肽序列，没有明确的亚细胞定位，不含有跨膜结构域，结合当前文献有关Sir2蛋白的报道，推测EtSir2为胞浆蛋白，在细胞内发挥作用，可能与柔嫩艾美耳球虫转录调控有关。对EtSir2进行三维结构预测并模拟3D空间构象，结果显示EtSir2蛋白分为大小2个亚基，存在NAD＋及Zn2＋的保守结合位点，推测EtSir2具有依赖NAD＋的去乙酰化酶活性。构建pET43a－EtSir2重组表达载体，进行原核表达并于可溶性上清液分离得到重组蛋白，推测该蛋白具有酶活性，在柔嫩艾美耳球虫基因调控过程中发挥重要作用。

本研究获得了Et Sir2的基因序列，构建了重组质粒pET43a－EtSir2并获得了可溶性重组蛋白，为进一步研究其生物学功能，以及以其作为靶标筛选新型抗球虫药物奠定了基础。

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