侵染西方蜜蜂的瓦螨种类鉴定

代平礼，周 婷，刁青云，王 强，吴艳艳

（中国农业科学院蜜蜂研究所 农业部授粉昆虫生物学重点开放实验室，北京100093）

已报道的蜜蜂外寄生螨主要有12 种，分别属于瓦螨科（Varroidae）、厉螨科（Laelapidae）和蜂盾螨亚科（Acarapinae）［1］。瓦螨（Varroa）主要包括雅氏瓦螨（V.jacobsoni）、狄斯瓦螨（V.destructor）、恩氏瓦螨（V.underwoodi）和林氏瓦螨（V.rindereri），危害西方蜜蜂的主要为狄斯瓦螨（Varroa destructor）［2-3］。狄斯瓦螨包括不同基因型，危害西方蜜蜂（Apis mellifera）的是朝鲜基因型和日本／泰国基因型。朝鲜基因型不但分布广泛，而且其致病性也比日本基因型强，所以对西方蜜蜂的危害也较日本基因型更严重［4］。目前，危害中国西方蜜蜂的狄斯瓦螨均为朝鲜基因型，未发现日本基因型［5］。阿根廷也是世界养蜂大国，主要饲养西方蜜蜂，2009年蜂群为297万群，瓦螨是危害蜂群的主要害虫［6］。鉴于此，本文对来自阿根廷的瓦螨样本进行mtDNA CO1基因序列分析和限制性内切酶酶切，来确定其基因型。

1 材料与方法

1.1 材料

瓦螨样本来自阿根廷，将样本编号并放入950mL／L乙醇中4℃保存备用。

1.2 方法

1.2.1 总DNA提取 将蜂螨样品在70mL／L乙醇中洗涤，用吸水纸吸干，放入40μL 2×WLB（worm lysis buffer）缓冲液中研碎，50℃孵育1h，100℃煮沸10min～15min，冷却，加入40μL无菌纯水。

1.2.2 PCR反应引物 序列：WX-990422：ATTTATTTTGATTTTTTGGACA ；ZSF-20060123：AGCCCCTATTCTTAATACATAG 。反应体系为50μL，其中25μL Mix，正反引物各1μL，DNA 模板10μL，纯水13μL。反应条件：94℃预变性5min；94℃60s，50℃65s，72℃90s，30个循环；72℃5min。

1.2.3 序列测定 PCR产物经12g／L琼脂糖凝胶电泳检测，送北京华大基因公司测序。

1.2.4 序列分析 序列分析采用Bio Edit Sequence Alignment Editor进行分析，序列同源性比对在NCBI（http：／／www.ncbi.nlm.nib.gov／）Blast完成。

1.2.5 限制性内切酶酶切瓦螨样品mtDNA CO1基因序列SacⅠ限制性内切酶消化，buffer L 2μL，SacⅠ1μL，纯水8μL，PCR 产物7μL，37 ℃水浴2h；XhoⅠ限制性内切酶消化，buffer H 2μL，XhoⅠ1μL，纯水8μL，PCR 产物7μL，37 ℃水浴2h，12g／L琼脂糖凝胶电泳，分析酶切结果。

2 结果

2.1 PCR 扩增结果

对目的片段进行扩增，PCR 产物用12g／L的琼脂糖凝胶电泳检测，24 个样本扩增片段大小均为458bp，无非特异性扩增条带，可以将扩增的基因片段进行测序（图1）。

2.2 限制性内切酶酶切瓦螨样品mtDNA CO1基因序列

蜂螨样本CO1基因458bp片段仅能被限制性内切酶XhoⅠ切断，不能被限制酶SacⅠ切断（图2），均为狄斯瓦螨朝鲜基因型。

2.3 mtDNA CO1基因片段测序及基因型鉴定

所有的测序结果与酶切片段长度多态性分析结果相吻合，25份样品均为狄斯瓦螨朝鲜基因型。

图1 部分瓦螨样品mtDNA CO1 基因PCR 扩增结果Fig.1 PCR results of mt DNA CO1gene for part samples of Varroa

图2 限制性内切酶酶切瓦螨样品mtDNA CO1基因序列Fig.2 Restriction enzyme analyses of varroa mite mtDNA CO1gene

3 讨论

狄斯瓦螨是对世界养蜂业危害最大的蜜蜂病虫害［7-13］。狄斯瓦螨已发现11 个基因型，危害西方蜜蜂的是朝鲜基因型和日本／泰国基因型，其中朝鲜基因型分布广泛，危害欧洲、非洲、亚洲、美洲和新西兰的西方蜜蜂，日本基因型只分布于日本、泰国和南北美洲［5］。本文研究结果显示，阿根廷的25份来自西方蜜蜂的瓦螨样本均属于狄斯瓦螨朝鲜基因型。限制性内切酶酶切分析是鉴别狄斯瓦螨朝鲜基因型的最简便快捷的方法。只有狄斯瓦螨的朝鲜基因型仅能被限制性内切酶XhoⅠ切断，不能被限制酶SacⅠ切断。原因是朝鲜基因型的CO1基因458bp片段中，第167个碱基发生变异，由腺嘌呤（A）转换为鸟嘌呤（G），失去了限制酶SacⅠ的识别位点GAGCTC，变为GGGCTC，所以不能被切断。限制性内切酶酶切分析结果与测序结果相吻合。狄斯瓦螨种内可能还包括其他基因型。随着分子生物学的发展，狄斯瓦螨的分类学研究将更加深入，这将为其防治提供参考。

［1］罗其花，周 婷，王 强，等.蜂螨的种类及蜜蜂主要害螨研究进展［J］.中国农业科学，2010，43（3）：585-593.

［2］Anderson D L，Trueman J W H.Varroajacobsoni（Acari：Varroidae）is more than one species［J］.Exp Appl Acarol，2000，24：165-189.

［3］周 婷，王 强，姚 军，等.中国狄斯瓦螨的研究进展［J］.中国蜂业，2007，58（2）：5-7

［4］Zhou T，Anderson D L，Huang Z Y，et al.Identification ofVarroa mites（acari：varroidae）infestingApis ceranaand Apis mellifera in China［J］.Apidologie，2004，35：645-654

［5］周 婷.狄斯瓦螨的生物学特性及在我国的自然分布［D］.北京：中国农业大学，2004.

［6］刁青云，颜志立，石 巍，等.阿根廷蜂业管理、生产、出口及科研概况［J］.世界农业，2012，394：70-73.

［7］Calderon R A，Urena S，van Veen J W.Reproduction ofVarroa destructorand offspring mortality in worker and drone brood cells of Africanized honey bees［J］.Exp Appl Acarol，2012，56：297-307.

［8］Giovenazzo P，Dubreuil P.Evaluation of spring organic treatments againstVarroa destructor（Acari：Varroidae）in honey beeApis mellifera（Hymenoptera：Apidae）colonies in eastern Canada［J］.Exp Appl Acarol，2011，55：65-76.

［9］Guzman-Novoa E，Emsen B，Unger P，et al.Genotypic variability and relationships between mite infestation levels，mite damage，grooming intensity，and removal ofVarroa destructormites in selected strains of worker honey bees（Apis mellifera L.）［J］.J Invertebrate Pathol，2012，110：314-320.

［10］Kozak P R，Currie R W.Laboratory study on the effects of temperature and three ventilation rates on infestations ofVarroa destructorin clusters of honey bees（Hymenoptera：Apidae）［J］.J Econom Entomol，2012，104：1774-1782.

［11］Locke B，Forsgren E，Fries I，et al.Acaricide treatment affects viral dynamics inVarroa destructor-infested honey bee colonies via both host physiology and mite control［J］.Appl Environ Microbiol，2011，78：227-235.

［12］van Dooremalen C，Gerritsen L，Cornelissen B，et al.Winter survival of individual honey bees and honey bee colonies depends on level ofVarroa destructorinfestation［J］.PLoS One，2012，7：e36285.

［13］苏晓玲，郑火青，胡福良.狄斯瓦螨生物学及生物防治研究进展［J］.蜜蜂杂志，2011（5）：5-8.