傅立叶变换红外光谱技术在生物技术领域中的应用

王 晨，胡昌勤 （中国食品药品检定研究院，北京 100050）

探索细胞的结构、特征和规律，研究类器官、单细胞甚至亚细胞动力学特性等内容是当前的研究热点［1］。目前，有包括免疫学、生物化学和分子显微技术在内的众多方法被人们用于从不同的角度对细胞组织进行分析。然而，这些方法大多属于损伤性检测，需要应用细胞固定、细胞溶解、提取以及分子探针等技术对待测物进行处理。荧光技术［2－3］需要细胞组织本身带有荧光标记物或者人为引入荧光性修饰基团，且应用范围局限性较大；免疫磁性纳米粒子细胞分离技术［4］需要复杂的前处理过程和严格的实验支持条件。

傅立叶变换红外光谱 （FTIR）技术是以4000～400cm－1连续波数的红外光对测定对象进行照射，通过采集透过或由测定对象表面反射的光谱，经傅立叶转换得到各波数光谱透过或被吸收的量，进而分析得到相应结果的一种分析方法。由于其检测具有快速和无损伤的特点，使得这项技术被广泛应用于细胞生物学、医学影像、组织工程和药理学等众多领域。FTIR技术在细胞组织研究中的应用可以提供一种快速、无试剂添加、无损伤的细胞生物学分析评价平台。具有测定时间短、精度高，并且可以进行多指标同时测定、非损伤性测定、连续测定等优点，是在线、实时、原位定性/定量分析测定的方法之一［5］。与前面提到的常规生化检验手段相比，FTIR用于细胞和组织生化分析时不需要固定剂、标记物或任何荧光染料。它是一种非接触技术，一种利用分子在红外辐射下所产生的特征振动吸收，对分子进行化学结构检定的分析手段，检测过程简便，得到的信息量丰富，可以同时进行多个指标的分析。本文重点介绍其重要应用实例。1 应用基础

细胞是器官和组织的最小组成单元，细胞中最基本的物质是核酸 （DNA、RNA）、蛋白质和双层磷脂膜：其中核酸由核苷酸构成，蛋白质由氨基酸构成，糖蛋白是糖与多肽的结合物，双层磷脂膜则属于脂类有机物。细胞的红外光谱由上述聚合物分子的振动光谱叠加组成，它反映了核酸、蛋白质、糖蛋白等分子在细胞内的量及构型构象等信息［6］。其红外光谱的差异可以说明细胞中上述物质组成的差异，进而揭示细胞发育状态、功能等的差异。

傅立叶变换红外光谱 （FTIR）技术在生物医学领域中的主要应用包括定性分析与定量分析。定性分析通常有两种方法：一种是利用以聚类分析为核心的化学计量学方法，将一组待测物的采集数据根据分析目的进行分类。利用不同分析对象在指纹区1800～600cm－1波数范围信号强度和位置的差异，通过合理的算法确定指纹信号的敏感区间与待测物特性的关系。另一种是根据待测物生化特征的差异，通过测定特定吸收峰波数的偏移和多个吸收峰的峰高比或峰面积比进行区别或评价。定量分析需要首先建立线性定量模型，通常通过制备一系列量值已知的待测物，根据待测样品的特点，选择单波数吸收、多波数吸收、波数吸收峰比或波数区间（指纹区间）等作为信息组，采用多元线性回归和交叉检验建立定量模型，再利用所建立的模型进行定量分析。实际研究中，可根据研究对象和研究目的单独选用一种分析方法，也可同时选用两种方法配合分析［5－9］。

FTIR分析的基础在于细胞中各种分子原子间振动光谱的叠加，应用FTIR进行细胞组织样品评价的最大阻碍是生物的多样性和非信息信号的干扰。生物多样性是指生物组织中细胞通常为非单一功能而是多类细胞的混合群体。以往的文献中常采用分离纯化的方法，通过前处理采集不同类细胞的红外光谱［6］，但这使得FTIR失去了快速、无损的测定优势。而采用FTIR与显微技术联用的方法，通过获取极小区域内的红外光谱信号，结合化学计量学算法对采集光谱进行分析，有望解决上述难题。非信息信号干扰主要指在红外光谱中水或其他组织液等的吸收峰掩盖了有价值的信息。解决这类问题有两种方式：第一种是干燥使待测物脱水。由于在红外数据的采集过程中，待测组织在载片上属于持续干燥过程，因此，可以采用重复、连续采集数据的方法，监视水峰的衰减，当水峰衰减至不影响其他信号峰时认定采集的数据有效。第二种方法是采用衰减全反射－傅立叶变换红外光谱 （ATRFTIR）的方式进行数据采集。本方法采集的是待测物的表面信号，因而，可以消除部分细胞组织中水和其他液体的干扰，但这种方法采集的信号较弱（相较透射FTIR），且透入距离短 （通常透入距离不超过几十微米），又限制了其应用［5］。2 应用实例

2.1 基于特征谱段的定性分析方法

Sun等采用FTIR技术对胆囊癌细胞及其细胞核结构进行研究［8］。通过对胆囊癌细胞与正常细胞的红外吸收光谱的比较发现：相对于正常细胞，癌细胞的红外光谱中碳氢伸缩振动吸收峰 （3000～2800cm－1）和与脂肪相关的羰基伸缩振动吸收峰（1740cm－1）的强度很弱或者消失；肿瘤组织的酰胺Ⅰ峰位通常≤1642cm－1；肿瘤组织的酰胺Ⅰ与酰胺Ⅱ的相对强度比 （I1642/I1550）≥1.9。碳氢伸缩振动吸收峰 （3000～2800cm－1）和羰基伸缩振动吸收峰 （1740cm－1）与脂类的含量有关；1460cm－1处谱带为碳氢的变角振动，也与细胞中的脂类有关。癌细胞及组织中的脂类分解代谢增强，致使癌细胞表面的糖脂趋于减少，导致组织细胞光谱中1460cm－1谱带强度降低，1460cm－1与1400cm－1吸收峰的相对强度比 （I1460/I1400）降低。较好地解释了由于恶性肿瘤生长迅速，耗能快，脂类物质难以在组织和细胞内堆积，造成恶性肿瘤中脂类成分含量减少的现象。上述结论也为FTIR应用于胆囊癌组织的定性诊断提供了细胞学基础。

2.2 基于谱段筛选建模的定性分析方法

肖璜等采用FTIR技术对药品控制菌进行鉴定［9］。采集大样本量经纯化的菌株信息，以 Wards算法 （离差平方和法）对采集的数据进行聚类分析，筛选适宜谱段，形成定性分析模型［10］。后续采集的未知菌光谱通过与该模型谱中所有代表性菌株光谱的逐一比较，达到菌株鉴定的目的。整个过程包括图谱采集、图谱预处理 （一阶导数的矢量归一化处理）、QT质检、代表性菌株的选择、谱段的选择与建库、结果验证等步骤。验证407株沙门氏菌，正确率为94%。验证241株大肠埃希菌，正确率为97%。

2.3 以筛选数据建立单点模型的定量分析

Yin hao等采用FTIR-ATR光谱技术对于人血红蛋白进行快速定量分析［5］。分别对全血和各稀释倍数的溶血液样品组进行光谱测定。采用多元线性回归 （Multple Linear Regresion，MLR）分析和交叉验证对每组样品分别建立定量模型。实验过程包括采用光谱全谱、选择指纹区建立MLR模型，筛选每一个波数的一元线性回归模型，从中遴选最好的单点模型。结果表明，每组样品的最优单点模型都有良好的预测效果。直接测定全血样品组的最优单点波形 （波数为1759cm－1）的交叉验证均方误差为4.9g·L－1、相对交叉检验均方误差为3.6%、预测相关系数为0.825。

2.4 采用红外显微技术分析单细胞光谱的变异

Krafft等采用FTIR技术观察人间质干细胞分化为成骨细胞的过程［11］。以红外显微镜采集、观测表层单细胞 （小于50μm），对培养7d的干扰组人间质干细胞和阴性对照组进行定性分析。阴性对照组细胞中具有较高水平的糖原累积信号表达；而干扰组人间质干细胞中有较高水平的磷酸钙信号表达。干扰组人间质干细胞红外光谱中酰胺Ⅰ（1631cm－1波数处）峰的吸收降低，可能与干扰作用下细胞中蛋白对应的Beta折叠 （beta-sheet）比例量降低有关。

2.5 原位红外光谱过程监测分析

D.Ami等采用FTIR技术对小鼠胚胎干细胞中mRNA的翻译过程进行监测［7］。连续7d测定培养细胞的吸收光谱，通过分析光谱数据的变化，发现观察期间蛋白质酰胺I特征谱段 （1600～1700cm－1）信号增强，核酸的特征谱段 （850～1050cm－1）信号减弱。推测可能原因是在mRNA的翻译进程中，DNA和RNA的整体水平呈下降趋势，蛋白质对应的Alpha螺旋比例增加。在第4～7d中，波数为899cm－1和954cm－1处出现新的DNA/RNA混合吸收谱带，推测为mRNA翻译过程中DNA/RNA中化学键相互作用的反映。

3 总结与展望

自1985年Benedetti等首次将傅立叶变换红外光谱 （FTIR）用于白血病病人淋巴细胞的研究［12］以来，FTIR在组织、细胞或亚细胞水平分析与评价中的应用日益增加。随着同步红外辐射技术的普及与发展，红外光谱采集的速度和质量有了进一步的提高；结合红外—显微镜技术和面扫描技术，目前，已经可以采集样品的阵列信息；而衰减全反射（ATR）技术［13］可以通过表面测试途径解决待测物中水信号的干扰问题；从而使得对细胞组织的活体非损伤检测成为了可能［14－17］。

化学计量学尤其是聚类分析和多元线性回归分析，是实现FTIR在生物医学领域应用的主要保证因素。由于红外光谱信号是振动光谱信号的叠加，而目前ATR-FTIR检测红外光的透入距离较短、信号较弱［18］，限制了它在更广泛领域中的应用。因此，发展抗干扰作用的化学计量学算法仍是当前研究的热点。

而从应用的角度，探索核酸在细胞分化过程中光谱信号变化正是目前研究较多的热点问题［19］。作为一种非损伤检测的分析方法，FTIR技术在生物医学中的应用必将随着科技水平的提高和与其他分析手段的联用而日益增加，并在生物、免疫、遗传等相关领域发挥越来越重要的作用。

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