文冠果壳皂苷提取物抑制酪氨酸酶活性的研究

张洪梅 周泉城

（山东理工大学农业工程与食品科学学院，淄博 255049）

文冠果是我国特有的珍贵优良木本油料树种，在生物柴油开发、新木材培植、水土保持以及观赏植物领域等各方面，都有着极大的开发利用价值［1］。近年来，由于文冠果具有较高的工业价值和营养价值，越来越受到人们的关注。如今我国大量种植文冠果，种仁多用于榨油，而果壳作为废弃物未得到有效的利用。研究表明，文冠果果壳中含有脂肪酸、甾醇、黄酮、皂苷等多种化学成分，其中皂苷类成分是其主要活性成分。

皂苷（Saponin）是广泛存在于植物界的一类特殊的苷类，。近年研究表明：文冠果总皂苷具有抗炎、抗肿瘤、抑制HIV蛋白酶、改善学习记忆以及提高人体抗糖尿等活性［2］。

酪氨酸酶（Tyrosinase）是一种结构复杂的多亚基的含铜氧化还原酶［3］，广泛的存在于微生物、动植物及人体中［4－7］。酪氨酸酶是目前黑色素代谢中唯一已知的酶，也是生物合成黑色素细胞的主要限速酶，在黑色素产生的过程中起着举足轻重的作用。酪氨酸酶活性高，产生的黑色素就会多；活性被抑制，黑色素产生能力就相应降低。异常过量表达可导致人体色素沉积性疾病。酪氨酸酶抑制剂可以治疗目前常见的色素沉积导致的皮肤病如雀斑、黄褐斑、老年斑等［8］。

目前，市场上流行的美白化妆品中增白剂多是酪氨酸酶抑制剂，如熊果苷、维生素C衍生物及一些中药提取物等［9］。此外，酪氨酸酶还与昆虫的伤口愈合与发育［6］，果蔬的褐变有密切关系［10－12］。因此，酪氨酸酶抑制剂也被用作食品保鲜剂。

本试验旨在确定文冠果壳中皂苷的提取方法，并对文冠果皂苷对酪氨酸酶的抑制作用进行研究，以期为文冠果壳的合理开发利用提供思路和依据，更高的发挥文冠果的经济价值。

1 材料与方法

1．1 试验材料

文冠果：陕西金道种业有限公司；酪氨酸酶（≥30 U／mg）：合肥博美生物科技有限公司，临用前以pH＝6．8磷酸缓冲液配成适宜浓度酶溶液；所用其他试剂均为国产分析纯。

1．2 试验设备

FZ102植物粉碎机：天津泰斯特仪器公司；RE 52－86E旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；SHB－111循环水式真空泵：郑州金育科贸有限公司；TDL－40B离心机：上海安亭科学仪器厂；UV－2102紫外－可见分析仪：尤尼柯仪器有限公司。

1．3 试验方法

1．3．1 文冠果皂苷提取

1．3．1．1 乙醇提取流程

文冠果壳粉末→石油醚脱脂→乙醇提取→过滤→浓缩

称取干燥恒重的文冠果果壳粉末20 g，置200 mL圆底烧瓶中，60～90℃石油醚脱脂3次，液料比5∶1，时间4 h。加入70%的乙醇140 mL，于70℃冷凝回流5 h。滤去残渣，回收乙醇至20%，继续回收乙醇得浸膏。将浸膏8倍水量溶解，3 500 r／min离心分离15 min，取上清液用乙酸乙酯（1∶1）萃取3次，除去部分杂质，水层继续用水饱和的正丁醇（1∶1）萃取3次，合并正丁醇相，浓缩得浸膏。

1．3．1．2 水提取流程

文冠果壳粉末→石油醚脱脂→水提→过滤→浓缩

称取干燥恒重的文冠果果壳粉末20 g，置200 mL圆底烧瓶中，60～90℃石油醚提取3次脱脂，液料比5∶1，时间4 h。加入去离子水（pH值为10．5～11．5）140 mL，于 90℃冷凝回流 120 min。滤去残渣，旋转蒸发浓缩，3 500 r／min离心分离15 min，取上清液用乙酸乙酯（1∶1）萃取3次，除去部分杂质，水层继续用水饱和的正丁醇（1∶1）萃取3次，合并正丁醇相，浓缩得浸膏。

1．3．2 样品中皂苷质量分数的测定

1．3．2．1 标准曲线

标准曲线按香草醛比色法操作［13］。人参皂苷Re标准曲线方程：Y＝2．963 2X－0．010 3，R2＝0．999 3。式中：Y为吸光度；X为皂苷的质量分数。

1．3．2．2 皂苷质量分数计算

将正丁醇相浓缩得到的浸膏用60 mL水溶解，经滤膜过滤，吸取0．5 mL加入100 mL的容量瓶中用甲醇定容至刻度制备成待测液。吸取0．5 mL于试管中，按香草醛比色法操作，3个平行，取平均值。根据标准曲线方程求出提取物中皂苷的质量分数。

回归方程：Y＝2．963 2X－0．010 3（R2＝0．999 3）

质量分数 ＝100NV（吸光度 ＋0．010 3）／（2．963 2×2．5×1 000M）×100%

式中：N为稀释倍数；V为溶液体积／mL；M为原料质量／g。

1．3．3 抑制酪氨酸酶活性试验

1．3．3．1 酪氨酸酶抑制活性测定方法及抑制率计算

［14］操作：酪氨酸酶活力以催化L－多巴氧化反应生成多巴醌的二酚酶活力来衡量。试管中加入L－多巴0．4 mL（1．0 mg／mL），pH＝6．8磷酸缓冲液2．4 mL，30℃水浴保温10 min后，加入酪氨酸酶0．2 mL（250 U／mL）混和均匀，酶促反应将L－多巴转化为红色产物多巴醌，在475 nm处有最大吸收。以每分钟A475增加0．001为1个酶活力单位，酶促反应的速度用每分钟A475增加值来表示。从混合均匀开始测量，每30秒测定1次，测到7 min。按如下两式计算相对酶活力和酶抑制率。

式中：A1为无澄清液有底物时的吸光度；A2为无澄清液无底物时的吸光度；A3为有澄清液与底物时的吸光度；A4为有澄清液无底物时的吸光度。

1．3．3．2 不同浓度皂苷提取液对酪氨酸酶活力的影响

按1．3．3．1方法，在试管中加入底物 0．4 mL，加入不同量的抑制剂，pH＝6．8磷酸缓冲液补充反应液至2．8 mL，30℃水浴保温10 min后，加入酪氨酸酶0．2 mL（250 U／mL）混和均匀测定各反应的吸光度变化，计算抑制率。

1．3．3．3 不同加酶量对抑制作用的影响

在30℃下取定量的底物溶液与定量的抑制剂，30℃水浴保温10 min，加入不同量的酪氨酸酶，测定各反应的吸光度变化，计算抑制率。

1．3．3．4 不同反应时间下对抑制作用的影响

取定量的底物溶液与定量抑制剂于30℃水浴保温10 min，然后加入定量的酪氨酸酶反应不同的时间，测定有无抑制剂加入情况下反应液的吸光度变化，计算抑制率。

1．3．3．5 文冠果皂苷对酪氨酸酶促反应动力学及抑制作用类型

其他条件相同，在反应体系加入定量酪氨酸酶，给定抑制剂浓度，测定底物浓度不同时酶反应的吸光值，求出相应的反应速度。按Lineweaver－Burk的双倒数作图法作图，确定抑制作用的类型，得出米氏常数Km、最大反应速度Vmax。

2 结果与分析

2．1 皂苷的提取与质量分数测定

分别采用醇提取法与水提取法对文冠果果壳进行浸提，分别测定不同浸提次数提取液的吸光度，带入回归方程计算皂苷的质量分数。

表1 文冠果壳皂苷质量分数

由表1可知，醇提取法和水提取法提取文冠果壳中皂苷质量分数分别为2．5%左右和1．5%左右。乙醇提取法测得文冠果壳中皂苷的质量分数较高，表明乙醇溶液作为提取剂更佳。选用醇提取液作为抑制剂，测定文冠果壳皂苷提取液对酪氨酸酶活性的抑制作用。

2．2 抑制酪氨酸酶活性试验

2．2．1 酪氨酸酶催化L－多巴氧化反应吸光度随时间的变化

酪氨酸酶催化L－多巴转化为红色产物多巴醌，反应液中颜色的深浅与产物的浓度成正比。考察反应液吸光度随反应时间的变化，试验结果见图1。由图1可知，随着时间的延长，反应体系的吸光度增大，即多巴醌的浓度增加，但曲线的斜率的逐渐减小，意味着反应速度降低。7 min时，曲线斜率接近零，反应不再进行，因此试验选择测定时间为0～7 min。

图1 酪氨酸酶催化L－多巴氧化反应进程曲线

2．2．2 不同质量浓度皂苷提取液对酪氨酸酶活力的影响

反应体系中底物质量浓度为0．133 mg／mL，加入不同量的抑制剂，补充pH＝6．8磷酸缓冲液保持反应液体积为3 mL，测定各反应在不同时间下的吸光度变化，进而得出不同浓度的抑制剂对酪氨酸酶活性的抑制率变化见图2。

图2 文冠果壳提取液对酪氨酸酶活性的抑制作用

由图2可知，文冠果皂苷对酪氨酸酶有抑制作用，反应时间相同时，抑制剂浓度增大，抑制率增加。但以0．24 mg／mL为界，质量浓度继续增加，抑制率趋于平稳，最高可达64．6%，表明文冠果皂苷对酪氨酸酶的抑制率与浓度呈非线性变化。同质量浓度的抑制剂对酪氨酸酶活性的抑制作用随着时间的延长而降低。质量浓度为0．24 mg／mL的抑制剂作用于酪氨酸酶，反应时间为1 min时抑制率为63．8%，反应时间为7 min时，抑制率为55．2%。

2．2．3 不同加酶量对抑制作用的影响

在30℃下取定量的底物溶液与定量的抑制剂，30℃水浴保温10 min，加入不同量的酪氨酸酶，测定各反应在不同时间下的吸光度变化，进而计算不同加酶量对酪氨酸酶活性抑制作用的影响，见图3。

图3 加酶量对酪氨酸酶活性抑制作用的影响

由图3可以得知：当底物与抑制剂浓度一定时，在酪氨酸酶浓度为4．167～25 U／mL之间，酶量对抑制率无明显影响，表明文冠果皂苷提取液对酪氨酸酶的抑制作用较稳定。

2．2．4 不同反应时间时皂苷提取液对酪氨酸酶抑制作用的影响

取定量的底物溶液与定量抑制剂于30℃水浴保温10 min，然后加入定量的酪氨酸酶反应不同的时间，分别测定抑制剂质量浓度为 0．24、0．36、0．48、0．60 mg／mL下反应液的吸光度变化，得出不同反应时间时，抑制剂对酪氨酸酶抑制率的变化见图4。

图4 反应时间对酪氨酸酶活性抑制作用的影响

由图4可以得知：不同质量浓度的皂苷提取液对酪氨酸酶活性抑制率的变化趋势一致，反应初始时抑制率最高，随时间的延长逐渐降低。

2．2．5 文冠果皂苷对酪氨酸酶促反应动力学的影响及抑制作用类型

固定抑制剂质量浓度（0、0．024 mg／mL）及定量的酪氨酸酶，测定不同底物浓度时酶促反应的残余酶活，求出相应的反应速率，用底物浓度对反应速率做图，结果如图5所示。

图5 底物浓度对反应速率的影响

用底物浓度的倒数和反应速率的倒数做图，得到相应相应的Lineweaver－Burk图，见图6。

图6 抑制作用Lineweaver－Burk图

从图6的动力学曲线可知：两条直线相交于横轴副轴上，交点坐标为（－0．8，0）。未加文冠果皂苷提取液的试验组动力学参数 Km＝1．25 mg／mL，Vmax＝0．12ΔA／min。加入提取液的试验组动力学参数Km＝1．25 mg／mL，Vmax＝0．09ΔA／min。结果显示加入抑制剂的试验组Km值不变，Vmax减小，表明文冠果壳皂苷提取液对酪氨酸酶的抑制作用类型为非竞争性抑制。文冠果皂苷作为抑制剂与酪氨酸酶活性中心以外的必需基团结合，不影响酶与L－多巴的结合，酶和L－多巴的结合也不影响酶与文冠果皂苷的结合，但是中间产物酶－L－多巴－文冠果皂苷复合物不能进一步释放出产物，从而抑制了L－多巴向多巴醌及向黑色素的转化。

3 结论

3．1 利用醇提取法和水提取法分别提取文冠果果壳中的皂苷物质，结果醇提取法测得质量分数为2．5%左右，水提取法质量分数1．5%。经过比较可以得知醇提取法能更加充分的提取出文冠果壳中的皂苷。在资源利用率和价值利用率上来讲，醇提法比水提法要好。

3．2 本试验发现，文冠果壳皂苷醇提取液对酪氨酸酶的活性存在一定抑制作用，且随浓度的增加对酶活性的抑制作用显著增强，当皂苷质量浓度为0．36 mg／mL时，抑制率可达到64．6%。因此，从文冠果壳中提取皂苷作为美白成分，既符合当前以天然药物为美容成分的发展趋势，同时又实现了废物利用，提高了农产品的经济价值。

3．3 文冠果壳皂苷提取液对酪氨酸酶的抑制作用符合非竞争抑制的特点，米氏常数为1．25 mg／mL。

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