内质网分子伴侣蛋白在压疮局部缺血性损伤中的表达*

崔飞飞，潘莹莹，张 龙，谢浩煌，时洪雪，肖 健，姜丽萍

（温州医学院护理学院，浙江温州325035）

压疮是临床常见的并发症，是皮肤或皮下组织由于压力，或复合有剪切力或／和摩擦力作用发生在骨隆突处的局限性损伤［1］。局部组织缺血、缺氧，可诱导内质网功能紊乱，诱发内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS），过强或持续的ERS导致细胞凋亡。葡萄糖调节蛋白78（glucose regulated protein 78，GRP78）、同源蛋白（homology protein，CHOP）是ERS的特异性蛋白，其可以反映ERS的程度，心、脑等缺血性损伤中已经对ERS相关蛋白介导的细胞损伤有所报道［2］，但在压疮损伤过程中的作用鲜见报道。

1 材料与方法

1.1 材料

健康成年雄性SD大鼠40只（上海斯莱克实验动物有限责任公司提供），体重320～350 g。大鼠自由饮水、进食，室温（25±2）℃，分笼喂养。GRP78、CHOP抗体均由 Santa Cruz Biotechnology提供，二抗和内参抗体分别由上海碧云天生物技术研究所和武汉博士德生物工程有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 模型制备及分组 参照王艳艳等［3］的方法制备早期压疮动物模型。40只SD大鼠自由饮水，腹腔注射麻醉后，将大鼠俯卧于泡沫床垫上，暴露施压部位。随机分为对照组、实验组分为1个周期组（1 c组）、3个周期组（3 c组）、6个周期组（6 c组）、9个周期组（9 c组）（n＝8），各组体重比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。1 c组：对两侧大腿股薄肌施加22.47 kPa压强，持续施压 2 h，放松 0.5 h，即 1个周期；3 c组、6 c组、9 c组：于同一部位施加等同大小的压强，同样周期分别重复3次、6次、9次（一天进行3个周期）；对照组：未施压力。各组大鼠于实验终点给予安乐死。

1.2.2 标本制备 实验终点，迅速取受压中心部位肌肉组织（约500mg），存于-80℃超低温冰箱保存备用，用于HE染色、免疫组化和Western blot检测。

1.2.3 组织形态学观察 组织常规脱蜡、梯度透明、苏木精-伊红染色，用 Nikon（TE2000-U）显微镜观察，NISElements图像采集软件采集图像，观察压疮局部肌肉组织病理学变化。

1.2.4 免疫组织化学法 采用 SABC法，常规设立阴性对照。3%H2O2处理后热修复抗原，5%BSA封闭，一抗 （1∶100）4℃过夜，生物素化二抗37℃孵育30 min，DAB显色，苏木精复染，中性树胶封片，镜下进行定性观察。

1.2.5 Western blot 取组织各200 mg，加入组织蛋白裂解液，匀浆后，离心取上清，按 Bradford法测量蛋白浓度。配制SDS聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。脱脂奶粉封闭1 h，加入一抗孵育，4℃过夜。TBST洗涤，加入辣根过氧化物酶标记二抗，孵育1 h，TBST洗涤。ECL显色、曝光，常规方法显影、定影。以GAPDH作为内参，用Image J软件分析系统分析，GRP78、CHOP蛋白含量分别用GRP78／GAPDH、CHOP／GAPDH表示。

1.3 统计学处理

实验数据以均数±标准差（±s）表示，使用 SPSS 16.0统计软件进行分析处理，组间差异采用单因素方差（one-way ANOVA）分析，组间两两比较采用最小显著性差异法（LSD法）。

2 结果

2.1 受压肌肉组织的病理改变

光镜下观察显示：对照组肌纤维排列紧密，形态正常，结构清晰，骨骼肌横纹清晰，无明显的炎性细胞浸润；实验组，受压肌肉组织逐步出现退化的病理变化，表现为肌纤维排列紊乱、水肿，肌间隙增宽，间质区域出现炎症细胞浸润，肌纤维出现溶解、断裂、坏死碎片、空泡变性、玻璃样变性等病理改变（图 1）。

2.2 各组受压肌肉组织中GRP78、CHOP蛋白表达

2.2.1 GRP78蛋白表达情况 免疫组化结果显示：GRP78免疫阳性产物呈棕黄色颗粒，主要位于胞浆，细胞形态相对饱满。GRP78蛋白在对照组中呈低表达，在1 c组表达不明显，3 c组表达显著，随后6 c、9 c组下降（图2）。

2.2.2 CHOP蛋白表达情况 免疫组化结果显示：其棕黄色颗粒，在胞浆和细胞核表达，多数阳性细胞形态已经发生改变，胞核呈固缩状。CHOP蛋白在对照组中呈低表达，在1 c组表达升高，3 c组、6 c组下降，9 c组再次升高（图3）。

Fig.2 Expression of GRP78 protein in compressed muscles tissue（IHC×200）

2.3 Western blot检测GRP78、CHOP蛋白在受压组织中的表达

Western blot结果表明：与对照组相比，GRP78蛋白1 c组开始表达，3 c组达到高峰（P＜0.05），6 c、9 c组表达下降（P＜0.05）；CHOP蛋白 1 c组升高显著（P＜0.05），3 c组开始下降（P＜0.05），6 c组下降明显（P＞0.05），9 c组再次升高（P＜0.05，表 1）。

Fig.3 Expression of CHOP protein in compressed muscles tissue（IHC×200）

Tab.1 Expression of GRP78，CHOP protein in compressed muscles tissue detected by Western blot（OD，±s，n＝3）

Tab.1 Expression of GRP78，CHOP protein in compressed muscles tissue detected by Western blot（OD，±s，n＝3）

GRP78：Glucose regulated protein 78；CHOP：Homology protein；C：Cycle*P＜0.05 vs control group

Group GRP78 protein CHOP protein Con 0.64±0.12 0.58±0.18 1c 1.20±0.34 1.48±0.27*3c 1.59±0.24* 1.03±0.21*6c 1.17±0.28* 0.95±0.30 9c 1.09±0.33* 1.69±0.34*

3 讨论

前期研究表明，压疮损伤的形成并非急性高压力所致的，而是由间歇性较低压力重复作用所造成的局部组织的不完全性缺血再灌注损伤［4］。此过程中内质网（endoplasmic reticulum，ER）功能发生紊乱，激活ERS反应。GRP78是ERS的敏感标记物，CHOP是特异凋亡蛋白。GRP78具有细胞的保护作用，ERS持续存在或过强时，激活CHOP蛋白表达，诱导细胞凋亡［5］。但压疮局部组织损伤与ERS介导的细胞功能障碍之间的关系研究较少。

本实验形态学结果表明，受压局部肌肉组织出现逐步退化病理变化，即炎症细胞增多、肌间隙增宽、肌纤维出现水肿、溶解、断裂、空泡化、玻璃样改变现象，这与臧爽等研究结果一致。这可认为，由于外部施加的压力诱发了组织缺血缺氧，当恢复血流灌注时，导致大量的氧自由基生成，同时伴随钙离子超载，造成细胞损伤。

生理状况下GRP78处于无活性状态，当发生ERS时，可诱导GRP78表达，来结合未折叠蛋白，减少其在ER腔内聚集，当ERS持续存在时，则激活下游的凋亡因子CHOP蛋白。本研究免疫组化和Western blot结果均显示GRP78和CHOP蛋白表达总体呈上升趋势，其早期表达可能与局部受压肌组织持续受压，导致受压组织缺血缺氧，产生自由基级联反应，使ER腔内的蛋白氧化修饰有关；GRP78在3 c表达达高峰而CHOP表达下降，揭示了ER中未折叠或错误折叠蛋白大量积聚，触发未折叠蛋白反应，加强ER对蛋白的折叠能力，来减轻ER的负荷压力，减少细胞损伤；但随着循环次数增加GRP78表达又下降而CHOP在9 c组表达却再次升高，提示由于持续受压和再灌注损伤的联合作用，局部组织缺血缺氧加剧，ER折叠酶或分子伴侣功能异常，导致ERS持续存在或反应过度，使GRP78无法处理ER堆积的错误蛋白，且诱导CHOP的表达来处理过度受损的细胞，以此来恢复ER内环境的稳态。李蕊君等报道GRP78在心肌细胞缺氧0.5 h即开始表达，缺氧1 h达到高峰，之后随着缺氧时间的延长表达逐渐下降；左群等报道，CHOP的表达表现为运动后呈上升趋势，1 d时出现第一次高峰，之后略有下降，1周达到高峰，2周时出现下降趋势，本实验结果趋势与其一致。

综上所述，ERS参与了压疮损伤过程，压疮损伤难以愈合的原因可能与ERS诱导的细胞损伤有关，但具体的细胞信号通路，需进一步研究。

【参考文献】

［1］ Stekelenburg A，Gawlitta D，Bader D L，etal.Deep Tissue Injury：How Deep is Our Understanding［J］.ArchPhysMed Rehabil，2008，89（7）：1410-1413.

［2］ DeGracia D J，Montie H L.Cerebral ischemia and the unfolded protein reasonse［J］.JNeurochem，2004，91（1）：1-8.

［3］ 王艳艳，孙海琴，张纯瑜，等.压疮早期动物模型制备及评价［J］.护理学杂志，2010，25（14）：1-5.

［4］ 蔡福满，姜丽萍，杨晔琴，等.褥疮不完全性缺血再灌注损伤简易模型的建立［J］.中国病理生理杂志，2009，25（4）：830-832.

［5］ Oyadomari S，Mori M.Roles of CHOP／GADD153 in endoplasmic reticulum stress［J］.CellDeathDiffer，2004，11（4）：381-389.