内皮祖细胞条件培养基对VSMCs增殖、迁移及粘附功能的影响*

吴海燕，楚海荣，李 宏，唐可欣，靖 旭，孙金隆，尹青令，成 敏△

（1.潍坊医学院麻醉学系，2.潍坊医学院医学研究实验中心，山东潍坊261053）

血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）增殖是动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）斑块形成和发展的关键病理环节。增殖的VSMCs由血管中层向内膜的迁移，导致内膜中VSMCs的大量积聚和结缔组织的形成，进而促进新生内膜形成和AS。通常情况下，体内VSMCs处于静息态，不会过度增生及向内膜迁移。但当内皮损伤和功能障碍时，可致使中膜VSMCs的功能及结构发生改变，导致新内膜的形成，而内皮细胞再生能够阻止由VSMCs增生带来的损害［1］。文献证实除成熟内皮细胞外，EPCs对维持内皮结构和功能的完整性具有重要作用。大量研究表明，EPCs参与受损内皮的修复不仅仅通过分化为内皮细胞整合入受损处，还可通过旁分泌的方式释放一些血管活性物质，包括前列环素（prostaglandin I2，PGI2）、一氧化氮（nitric oxide，NO）、血管生长因子（包括 VEGF，SDF-1，OGF-1，HGF）等［2，3］。为此，本研究观察 EPC-CM对 VSMCs增殖、粘附及迁移的影响，以期进一步阐明EPCs对心血管系统的保护作用，完善动脉粥样硬化等血管性疾病的发病机制，为EPCs移植治疗心血管系统疾病提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂

雄性SD大鼠，体重200 g左右（山东省潍坊医学院实验动物中心）；VEGF及 bFGF（peprotech）；M199、胎牛血清和胰蛋白酶（Hyclone）；Histopaque-1083（Sigma）；纤维连接蛋白（Roche）；Dil-LDL、FITCUEA（Molecular Probe），FITC-CD133、vWF-FITC及CD31-PE（BD）；Cell Counting Kit试剂盒（碧云天生物技术研究所）；Boyden小室（江苏海门麒麟仪器厂）。

1.2 EPCs分离培养和鉴定

1.2.1 EPCs分离培养 健康雄性SD大鼠，断颈处死，75%酒精浸泡10min后，无菌PBS冲洗长骨骨髓腔。Histopaque-1083密度梯度离心法分离单个核细胞，按105cells／cm2密度接种于预先包被有纤维连接蛋白的培养瓶中，使用15%胎牛血清的M199完全培养基培养，4 d后更换培养基。

1.2.2 EPCs的鉴定 贴壁细胞在37℃含Dil-LDL培养基中孵育4 h，然后用4%多聚甲醛固定细胞30 min。再将FITC-UEA加于上述标本，37℃孵育1 h。激光共聚焦显微镜下观察，红色和绿色双染色细胞为EPCs。流式细胞术（fluorescence-activated cell sorting，FACS）检测 CD133，vWF及 CD31的表达。

1.3 VSMCs分离培养和鉴定

无菌分离大鼠胸主动脉，纵向剖开，去除动脉外膜和内皮，将动脉中层剪成1mm×1mm小块，按每平方厘米3～5块的密度种植于玻璃培养瓶。粘有植块的瓶底朝上，放置6 h后，翻转培养瓶，使植块慢慢浸入培养基中。4～7 d，植块周围即可长出细胞，待细胞融合成片，常规消化传代。3～5代VSMCs用于实验。VSMCs鉴定采用α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）染色阳性，以及形态学典型的“峰和谷”样生长状态判定。

1.4 EPCs条件培养基（EPCs-CM）的制备

传代后的EPCs在底面积为25 cm2培养瓶中生长融合后，再继续培养3 d，用 PBS（pH 7.4）洗 3次，换成无血清M199培养基4ml，24 h后收集培养基，1 500 r／min离心 5 min，取上清液即为 EPC-CM。EPC-CM经0.22μm滤膜过滤，贮存于-80℃冰箱中，备用。实验中以无血清的M199培养基为对照组。

1.5 CCK-8试剂盒检测VSMCs增殖

取处于对数生长期的VSMCs，按2×105cells／ml密度接种至12孔板。待细胞融合至80%左右时，用2%胎牛M199同步化12 h，然后以无血清M199或EPC-CM继续培养24 h后，用胰蛋白酶消化收集贴壁细胞，接种细胞悬液100μl（约5 000-10 000个细胞）于96孔板内，每组种5个复孔。待细胞融合80%左右，弃去各孔培养基，加入CCK-8试剂和培养基的混合液（按1∶10比例），在培养箱内孵育30～60 min，利用酶标仪测定各孔在450 nm波长的吸光度。

1.6 VSMCs粘附功能的观察

VSMCs经上述方法处理后，按 2×105cells／ml密度接种至包被有人纤维连接蛋白的24孔培养板中，37℃下培养30 min，PBS洗涤去除未贴壁细胞，显微镜下随机选取9个视野（×200），计数贴壁细胞，取其平均数。

1.7 改良Boyden小室检测VSMCs迁移能力

按上述方法收集贴壁细胞并计数。将200μl培养液加入改良的Boyden小室的下室，50μl VSMCs（2×104）悬浮液注入上室，置于37℃、5%CO2和饱和湿度的培养箱内。8 h后，刮去滤膜上面的未移动细胞，PBS洗涤3次，4%多聚甲醛固定，DAPI染色，显微镜下随机选取5个视野（×200），计数迁移细胞，取其平均数。

1.8 统计学分析

所有实验均重复3～4次。采用SPSS 13.0进行统计分析，实验数据以均值±标准差（±s）表示。组间差异采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。

2 结果

2.1 EPCs培养和鉴定

刚分离的单个核细胞大多呈悬浮生长，培养4 d后，贴壁细胞数量增多且呈梭形，培养7 d的细胞有集落样结构出现，培养21 d的细胞呈明显铺路石样外观（图1A-C）。Dil-ac-LDL和 FITC-UEA-1染色呈双阳性表现（图1D-F），FACS结果显示：干细胞标志物CD133阳性细胞率较低，而内皮细胞标志物vWF及CD31阳性细胞率较高（图1G，图1见彩图页Ⅱ）。

Fig. 1 Characterization of EPCs derived from rat bone marrow（A-F ×100）

Fig. 2 VSMCs morphology and identification（A and B ×100，C ×400）

2.2 VSMCs培养和鉴定

培养4～7 d，细胞以垂直方向从组织块边缘游离出，向外生长形成细胞晕，进而形成细胞簇。细胞形态呈现多形性，如长梭形、三角形或不规则形，折光性强，有长短不一的胞突（图2A）。细胞密度高时呈典型的“峰-谷”生长（图2B）。免疫荧光的鉴定结果显示，培养的VSMCs表达平滑肌细胞特异性α-SMA（图2C，图2见彩图页Ⅱ）。

2.3 EPC-CM对VSMCs增殖的影响

CCK-8试剂盒检测结果显示：EPC-CM处理组与无血清M199培养基（对照组）比较，其OD值显著降低（P＜0.01，图 3），提示 EPC-CM抑制了 VSMCs的增殖。

Fig.3 EPC-CM decreased VSMC proliferation（±s，n＝5）

2.4 EPC-CM对VSMCs粘附的影响

粘附实验检测发现，与无血清M199培养基培养的VSMCs相比，EPC-CM处理抑制了VSMCs的粘附（P＜0.01，图 4）。

Fig.4 EPC-CM inhibited VSMC adhesion（±s，n＝9）

2.5 EPC-CM对VSMCs迁移的影响

Boyden小室检测显示：与对照组相比，EPC-CM条件培养基显著抑制VSMCs迁移，差异具有统计学意义（P＜0.01，图 5见彩图页Ⅱ）。

Fig. 5 EPC-CM impaired VSMC migration（x ± s，n=5）

3 讨论

AS所致的心、脑血管疾病是当今严重危害人类生命健康的疾病之一，其发病率和死亡率均居各种疾病之首。研究表明，血管内皮功能障碍是其始动因素，当血管损伤后，中膜的VSMCs发生表型转化，由收缩型转化为合成型，相对稳定的VSMCs进行增殖，随之大量VSMCs迁移至内膜，导致血管受损处大量VSMCs的粘附，血管壁变厚，弹性降低，促进了动脉粥样硬化和新生内膜的形成［4］。

内皮细胞损伤势必诱发机体一系列反应，对其进行修复，以实现受损内皮的重新内皮化。传统观点认为损伤周边的内皮细胞可通过迁移、增殖来修复内皮缺损。但成熟内皮细胞是终末分化细胞，其增殖潜能有限，修复能力并不理想［5］。EPCs是一类能增殖并分化为血管内皮细胞的前体细胞，出生后EPCs主要存在于骨髓，缺血及血管内皮损伤等因素可以促进EPCs由骨髓动员到外周血中，迁移并粘附到损伤处［6］。实验证实 EPCs移植在冠心病、高血压、血管成形术后再狭窄等血管性疾病中发挥了积极的治疗作用，表现为降低血管损伤后血管内膜增殖、预防支架植入术后支架内血栓形成和再狭窄等［7］，提示：EPCs可能抑制 VSMCs的病理性增殖及功能。方立等［8］实验表明EPCs与VSMCs共培养可抑制后者增殖。然而EPCs如何参与调控VSMCs功能尚不清楚。最近研究［9］证实：EPCs的许多生物学功能主要是通过其旁分泌实现的。而检测其旁分泌作用对细胞的影响，最简单的方法就是使用“条件培养基”，就是将一种细胞（细胞A）的条件培养基（含该细胞分泌物或代谢产物）作用于另一种细胞（细胞B），观察其对细胞 B相关功能的影响［10］。本实验中，我们采用 EPC-CM培养 VSMCs，结果显示 EPCCM作用VSMCs 24 h以后，VSMCs的增殖、迁移和粘附能力均受到抑制。

理论上讲，条件培养基对细胞功能起负调节还是正调节作用，是由条件培养基中刺激活性物质和抑制活性物质之间的平衡决定。在本实验条件下，EPC-CM中抑制活性可能占优势，因此表现为对VSMCs功能的负性调控作用，这与生理状态下体内VSMCs处于静止和非增殖状态相符合。然而EPCCM影响VSMCs相关功能的确切机制，EPCs分泌的何种生物活性物质在其中发挥主导作用，以及是通过哪些途径来发挥作用有待于进一步研究，将有助于我们进一步揭示AS的发病机制，并为经皮冠状动脉成形术（PTCA）术后再狭窄的治疗提供新的思路。

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