18β-甘草次酸对W istar大鼠和自发性高血压大鼠脑微动脉平滑肌细胞缝隙连接的影响*

陈新燕，司军强，李 丽，赵 磊，魏丽丽，蒋学伟，马克涛

（石河子大学医学院地方病与民族高发病教育部重点实验室，生理学教研室，新疆石河子832002）

缝隙连接是相邻细胞间直接进行信息、能量和物质交换的通道，参与细胞间物质交换的代谢偶联和电信号传递的电偶联，对细胞的新陈代谢、内环境稳定、增殖等生理过程起着重要的调控作用。缝隙连接是由连接相邻两个细胞之间的连接通道排列而成的一种特殊膜结构。缝隙连接的基本单位称连接子，每个连接子由6个相同或不同的连接蛋白亚单位环绕，中心形成约1.5 nm的孔道，相邻细胞膜上的两个连接子对接便形成2～3 nm的缝隙连接。高血压是全球最常见的慢性病，各类高血压都源于血管紧张度的改变。缝隙连接在血管平滑肌舒缩运动中起到关键调节作用，它是电化学信号在细胞间传递的直接通路，使得相邻平滑肌细胞内的钙离子实现同步化改变。研究发现连接蛋白和高血压有着密切的联系。例如，特异性敲除血管内皮细胞连接蛋白43和连接蛋白40基因后，小鼠出现高血压和心肌肥厚［1］。连接蛋白40基因多态性是高血压的危险因素［2］。此外，Saltman等报道应用缝隙连接阻断剂庚醇通过阻断心肌细胞间的缝隙连接通讯，能够显著的减少梗死面积［3，4］。因此，缝隙连接阻断剂将会是治疗心脑血管疾病非常重要的工具。18β-GA是强效的非选择性的缝隙连接阻断剂，是目前生物学研究中较常用的缝隙连接阻断剂。本实验在急性分离正常血压Wistar大鼠和自发性高血压大鼠（spontaneously hypertensive rat，SHR）脑微动脉标本上应用全细胞膜片钳技术，观察18βGA对血管脑微动脉平滑肌细胞间缝隙连接的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物及标本制备

选择36周龄雄性SHR及正常血压Wistar大鼠，分别购自北京维通利华实验动物有限责任公司和新疆医科大学实验动物中心。SHR为实验组，Wistar大鼠为对照组，每组各10只。大鼠在麻醉状况下放血处死，迅速取出大脑，置于生理盐溶液中，溶液成分（mmol／L）如下：NaCl 138.0，KCl 5.0，CaCl21.6，MgCl21.2，Na-HEPES 5.0，HEPES 6.0，葡萄糖 7.5。在生理盐溶液中，迅速取出脑动脉及其分支。

脑微动脉段标本制备：将截取好的脑动脉（brain artery，BA）标本置于培养皿中，动脉两端用细铂金片固定在培养皿底部，放入含有胶原酶A（1.5mg／ml）的生理盐溶液在37℃温箱中处理15 min，生理盐溶液置换两次去除残存胶原酶A，显微镜下进一步去除结缔组织。将处理好的脑动脉转移至倒置显微镜下进行全细胞膜片钳实验。

单个平滑肌细胞制备：将脑微动脉及其分支置于细胞分离液中 20 min，分离液成分为（mmol／L）：NaCl 142，KCl 5，CaCl20.05，MgCl21，Na-HEPES 4，HEPES 5，葡萄糖7.5。移去细胞分离液将脑微动脉剪成几段放入消化液并在37℃温箱中消化20～25 min，消化液成分包括（mg／ml）：胶原酶 IA 1，木瓜蛋白酶 0.75，牛血清白蛋白 3.75，二硫苏糖醇 0.3。1 000 r／min离心6min后弃上清液，加入细胞分离液制成细胞悬浮液，反复替换三次后，将液体移至用多聚赖氨酸处理过的培养皿内，静置30 min使细胞贴壁后进行全细胞膜片钳实验。

1.2 全细胞膜片钳记录

在室温条件下（22～25℃）标本持续灌注生理盐溶液（0.2ml／min）进行全细胞膜片钳实验。记录电极阻抗约为5 MΩ，由P-97拉制仪拉制。电极内液成分是（mmol／L）：K-gluconate 130，NaCl 10，CaCl22.0，MgCl21.2，HEPES 10，EGTA 5，葡萄糖 7.5。通过微操纵器接触到细胞后给予负压形成GΩ封接。补偿电极电容后给予瞬时较强负压或者电刺激击破细胞膜形成全细胞膜片钳，膜电流用10 kHz（-3 dB）低频滤过［5］。通过PC计算机记录生物电信号。形成全细胞记录模式后，钳制电压为-40 mV，-140 mV至＋60mV为电压刺激区间，实验中选取此电压区间的I／V曲线率作为记录细胞静息状态下的 Ginput和Rinput，平滑肌细胞的Cinput则通过公式C＝Q／V获得。由电极电阻（Ra）引起的实际钳制电压（Vm）与命令电压（Vc）误差通过公式Vm＝Vc-I×Ra进行离线补偿。

1.3 试剂

所用药物用生理盐溶液配制，通过开关控制药物灌流标本，保持灌流速度、温度和其它成分不变。用生理盐溶液配制不同浓度的18β-GA，浓度一次为（μmol／L）：0.001，0.01，0.1，1，10，100。18β-GA由Sigma公司提供，其余试剂均为国产分析纯试剂。

1.4 统计学分析

结果以均数 ±标准差（±s）表示，应用 SPSS 16.0统计学软件进行统计学处理，组间比较采用t检验。

2 结果

2.1 SHR和W istar大鼠尾动脉血压

SHR的收缩压为（187.7±9.6）mmHg，明显高于正常 Wistar大鼠的收缩压（121.2±10.6）mmHg（P＜0.01）。

2.2 SHR脑微动脉平滑肌细胞间缝隙连接耦联力增强

SHR和Wistar大鼠脑动脉平滑肌细胞膜电容分别是（95±18）pF和（178±54）pF，差异有统计学意义（P＜0.05）。细胞膜电导分别是（3.42±1.17）nS和（7.90±0.89）nS，差异有统计学意义（P＜0.05）。细胞膜电阻分别是（331±79）MΩ和（139±17）MΩ，差异有统计学意义（P＜0.05，表 1）。

2.3 18β-GA抑制W istar大鼠和 SHR脑微动脉平滑肌细胞间缝隙连接

表1总结了18β-GA对Wistar大鼠和SHR脑微动脉段上平滑肌细胞 Rinput、Ginput和 Cinput的影响，结果发现应用 100μmol／L 18β-GA后细胞的 Rinput、Ginput和Cinput与单个平滑肌细胞数值十分接近。此外，对正常Wistar大鼠和SHR细胞膜电容充放电用单指数方程分别进行拟合（图1A和B中虚线部分），应用18β-GA前拟合效果较差（r＞0.90），应用 100 μmol／L 18β-GA后拟合效果很好（r＞0.98），且细胞Cinput的充放电的时间也显著降低。

Tab.1 Influence of18β-GA on themembrane properties of smoothmuscle cells in the cerebral arteriolar segments（n＝12）

Fig.1 18β-GA inhibits the gap junctionsbetween the smoothmuscle cells ofWistar rat and SHR

应用斜坡电压刺激发现，18β-GA净电流 I／V曲线几乎是线性（图2），且18β-GA净电流翻转电位点与脑微动脉段上平滑肌细胞静息膜电位十分接近。提示18β-GA主要抑制细胞间的缝隙连接，减少细胞的Ginput。

Fig.2 The 18β-GA induces net current I-V curves

18β-GA对Wistar大鼠和SHR脑微动脉平滑肌细胞间缝隙连接的抑制具有浓度依赖性（图3），0.001～100μmol／L的 18β-GA可以浓度依赖的抑制BA脑微动脉段上平滑肌细胞Ginput。18β-GA抑制Wistar大鼠和SHR脑微动脉段上平滑肌细胞Ginput的 IC50分别为 1.7和 2.0μmol／L，两种脑微动脉间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

本实验发现SHR脑微动脉段上平滑肌细胞Cinput和Ginput高于Wistar大鼠，提示SHR脑动脉平滑肌细胞间缝隙连接耦联力增加，其可能的意义是SHR通过提高细胞间的电化学信息传递，保持血管舒缩的同步性。众所周知，血管紧张度的增加是心脑血管疾病发病的关键，而以细胞间的缝隙连接为途径进行细胞间直接信息交流的异常改变与血管紧张度密切相关［6］。血管脑微动脉上缝隙连接通道存在于平滑肌细胞间、内皮细胞间以及平滑肌细胞和内皮细胞间［7-9］。通过缝隙连接通道传递电信号和化学物质交流，这就使得血管脑微动脉能够在纵向上和横向上保持电活动、机械活动的同步性，使整个血管成为统一的功能单位，对兴奋性或非兴奋性物质作出统一的反应，维持了血管功能的稳定和一致。而在病理情况下，异常细胞的伤害性信息也可通过缝隙连接传递至正常细胞引起病理性改变。

Fig.3 Concentration-dependent inhibition by 18β-GA of themembrane input conductance（Ginput）of the smoothmuscle cells of Wistar ratand SHR

本实验还发现在急性分离的Wistar大鼠和SHR脑微动脉上18β-GA可以浓度依赖的抑制平滑肌细胞间缝隙连接。此结果通过以下三个方面得以证实：（1）18β-GA可使脑微动脉段上平滑肌细胞Rinput增加或者Ginput减少至单个细胞水平。（2）应用18β-GA后脑微动脉段上平滑肌细胞Cinput值与单个平滑肌细胞的Cinput值相似。（3）应用18β-GA前，脑微动脉段上记录平滑肌细胞膜充放电时间远高于单个平滑肌细胞，且单指数方程拟合的效果很差。应用18β-GA后，细胞膜充放电时间降低到单个细胞水平，且单指数方程可以很好的拟合［10］。以上结果提示当 18β-GA浓度≥100μmol／L时可以完全阻断Wistar大鼠和SHR脑微动脉平滑肌细胞间的缝隙连接。此外，18β-GA对Wistar大鼠和SHR脑微动脉平滑肌细胞间缝隙连接的抑制效力相似。

总之，本研究中我们应用膜片钳技术从缝隙连接阻断剂18β-GA对Wistar大鼠和SHR缝隙连接的影响做了初步研究，提示自发性高血压脑动脉平滑肌细胞间的缝隙连接的表达或功能增强，促使缝隙连接耦联力增强，保持了血管舒缩的同步性。这对了解细胞间的相互调节机制，以及在病理条件下的变化具有重要的意义，并可能成为干预病变的新靶点，也为临床治疗心脑血管疾病开辟了新的依据和思路。随着今后在血管性疾病中功能和各种调节机制认识的不断提高，必将为治疗心脑血管疾病提供更多有价值的临床信息。

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