微生物发酵法制备大豆ACE 抑制肽菌种的筛选

李 响，刘 畅，吴 非*

(东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030)

微生物发酵法制备大豆ACE 抑制肽菌种的筛选

李 响，刘 畅，吴 非*

(东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030)

以大豆分离蛋白为底物，以血管紧张素转化酶(ACE)抑制率和肽含量为检测指标，选择5株乳酸菌、3株霉菌和1株枯草芽孢杆菌为出发菌种，通过微生物发酵筛选出具有高ACE抑制活性的发酵菌株。结果表明：乳酸菌中具有强ACE抑制活性的菌株为保加利亚乳杆菌，ACE抑制率和肽含量分别为57.93%和3.27mg/mL；霉菌中具有强ACE抑制活性的菌株为米曲霉，ACE抑制率和肽含量分别为41.23%和2.17mg/mL；枯草芽孢杆菌ACE抑制率和肽含量分别为45.02%和2.25mg/mL。综合比较9种菌株的发酵特性，选用保加利亚乳杆菌作为制备大豆抗高血压活性肽优良菌株。

微生物发酵；ACE抑制肽；大豆蛋白；ACE抑制活性

高血压是最常见的心血管疾病之一，它能造成大脑、心血管、肾脏的损害，是导致脑卒中、心力衰竭和冠心病等疾病的重要因素[1]。据报道，我国有1亿多人患有高血压，每年近100万人因高血压而死亡。在大豆血管紧张素转化酶(angiotensinⅠ-converting enzyme，ACE)抑制肽制备的研究中，主要有酶法和微生物发酵法两种。微生物发酵法主要利用的是发酵菌株的产酶及酶解能力[2]，目前应用较广的微生物主要有乳酸菌、枯草芽孢杆菌、放线菌、黑曲霉和米曲霉等。与直接酶解法相比，微生物发酵法成本低廉、工艺过程简便、条件温和，得率提高10%～20%，成本却仅为酶解法的50%～60%[3]。通过微生物作用对某些苦味肽基团进行修饰和重组，使小肽之间、小肽与氨基酸之间发生移接、重排。制得的大豆蛋白活性肽(ACEIP)具有溶解性好，无苦味和异味，口感好，受热不凝固等优点[4]，具有良好的应用前景和经济性。近年来，国外有很多关于发酵法制备ACEIP的研究，最早Yamamoto等[5]研究得出瑞士乳杆菌发酵乳的ACE抑制活性和肽含量均高于其他乳酸菌菌株。但是国内对于微生物发酵法制备ACEIP的研究还处于起步阶段，且从大豆蛋白中提取ACEIP的研究更少。在制备大豆ACE抑制肽的研究中，菌种的筛选尤为重要。不同的菌种所产的蛋白酶不同，对大豆蛋白的作用位点也不同，导致水解产物的ACE抑制活性差别很大[6]。因此本实验采用微生物发酵法，利用大豆分离蛋白为底物，以ACE抑制率和肽含量为检测指标，确定制备大豆ACE抑制肽的最佳菌株，为工业化生产具有降血压功能的发酵产品提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆分离蛋白 国家大豆工程技术研究中心；嗜热链球菌(Str)、保加利亚乳杆菌(Lb)、黑曲霉、米曲霉、根霉、枯草芽孢杆菌 东北农业大学食品学院；副干酪乳杆菌(KLDS 1.0201)、乳酸乳球菌乳酸亚种(KLDS 4.0303)和德氏乳杆菌保加利亚亚种(KLDS 1.0205) 教育部国家乳品科学重点实验室；改良MRS培养基、普通营养琼脂培养基、察氏培养基和土豆汁培养基。

血管紧张素转化酶(ACE)、马尿酰组氨酰亮氨酸(HHL)、十二烷基磺酸钠(SDS) 美国Sigma公司；邻苯二甲醛(OPA)、β-巯基乙醇(化学纯)；乙酸乙酯、盐酸等(分析纯)。

1.2 仪器与设备

TU-1800型紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司；XW-80A漩涡混合器 上海青浦泸西仪器厂；立式压力蒸汽灭菌锅 上海迅博实业有限公司；pHS-3C型pH计 上海伟业仪器厂；高速离心机 北京医用离心机厂；电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司；FD5-4型冷冻干燥机 美国西蒙公司；电热恒温水浴锅 北京市永光明医疗仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 大豆蛋白溶液的制备

取适量优质大豆分离蛋白粉，加入水与之混合配成溶液，使其底物质量浓度为5g/100mL，pH值自然。然后将配好的溶液进行巴氏杀菌，60℃加热30min。待混合液降温至25～28℃时备用。

1.3.2 菌种的活化

将5株乳酸菌菌株的冻存管分别转接到改良MRS液体培养基中，40℃静置培养16h。将黑曲霉和米曲菌的斜面保藏菌种转接到察氏培养基，根霉接种到土豆汁培养基中，30℃、200hg，振荡培养48h。将枯草芽孢杆菌的斜面保藏菌种转接到普通营养琼脂培养基中，37℃、200hg，振荡培养24h。

1.3.3 不同菌种的发酵分析

在无菌操作下，分别将活化好的5株供试乳酸菌、3株霉菌以及枯草芽孢杆菌以体积分数5%的接种量接种于灭菌大豆蛋白溶液中，起始pH值自然。每隔6h取样离心，取上清液进行冷冻干燥，测定其ACE抑制活性，确定最佳发酵时间，并观察不同菌株在发酵期间ACE抑制率和pH值变化情况。发酵结束后测定发酵液中的肽含量。

1.3.4 具有ACE抑制活性最佳菌株的筛选

根据9株菌株的发酵分析结果，综合比较不同菌株发酵液的ACE抑制活性、肽含量以及发酵时间，筛选出适合制备ACE抑制肽的最佳菌株。

1.3.5 发酵液中ACE抑制活性的测定

采用Cushman等[7]的紫外比色法进行ACE抑制活性的检测，并对该方法进行了改进。用0.1mol/L硼酸盐缓冲液(含0.3mol/L NaCl，pH8.3)将HHL配成5.0mmol/L的溶液。在 10mL 试管中加入120μL 5.0mmol/L HHL溶液和20μL样品，于37℃保温3～5min后，再加入10μL ACE溶液(溶解于蒸馏水中，活力为0.1U/mL)，混匀后在37℃保温1h，加入150μL 1.0mol/L的盐酸溶液以终止反应，再加入1mL醋酸乙酯，旋涡混合进行离心(4000hg，10min)；吸取1.0mL 750μL的醋酸乙酯层，120℃烘箱烘干，加入3.0mL去离子水，漩涡混匀30s后在波长228nm处测定光密度。同样条件下，以不加样品为对照组，不加样品和ACE溶液为空白组做平行实验。ACE抑制率按下式计算。

式中：ODb为不加样品，ACE与HHL完全反应的光密度，即对照组；ODa为ACE抑制剂和ACE溶液与HHL同时反应的光密度；ODc为空白组光密度。

1.3.6 发酵液中肽含量的测定

参考Church等[8]邻苯二甲醛的方法进行测定。取1mL发酵液加入200μL 0.75mol/L三氯乙酸溶液混匀，6000hg离心5min，取100μL上清液加入2mL OPA试剂，混匀后在340nm波长处测定其光密度，用100μL蒸馏水，加入200μL 0.75mol/L三氯乙酸溶液、6mL OPA试剂混匀作为空白对照。用亮氨酸作为标准品，配制梯度稀释溶液。取100μL标准品，加入2mL OPA试剂，漩涡混匀后在340nm波长处测定其光密度，绘制肽含量与光密度的标准曲线。通过标准曲线查出对应的亮氨酸的质量(µg)，计算样品溶液中的肽含量。

1.3.7 统计分析

采用Microsoft Excel(Office 2003)软件完成，实验数据采用SAS8.1软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌发酵大豆蛋白结果

分别将5株乳酸菌在最佳菌龄时以5%的接种量接种到大豆蛋白溶液中，37℃条件下发酵30h，发酵结果见图1、2。5株乳酸菌均具有ACE抑制能力，其中保加利亚乳杆菌的ACE抑制率和肽含量均为最高，分别为57.93%和3.27mg/mL，最佳发酵时间为30h。在发酵初期，菌株的产酸量小，发酵液中的ACE抑制活性较低，随着发酵时间的延长，发酵液的pH值下降趋势明显。在发酵12h后，发酵液逐渐开始凝乳，ACE抑制率明显增加，原因可能是乳酸菌发酵凝乳后能够促进ACE抑制肽的释放，使ACE抑制活性增强[9]。当发酵时间达到24h时，KLDS1.0201、KLDS 1.0205、 KLDS 4.0303和嗜热链球菌的ACE抑制率达到最大。24～30h，4株乳酸菌的ACE抑制率均有小幅度的降低，此时pH值降到5.5左右，可能是随着pH值的降低，酸度上升，乳酸菌的生长受到抑制，菌体活力也下降了[10-11]。但是保加利亚乳杆菌在发酵24h后、pH值低于5.5时，仍能缓慢生长，释放ACE抑制肽，这说明其耐酸性较好，使得ACE抑制率继续增加，达到57.93%，显著高于其他乳酸菌。

图 1 乳酸菌发酵过程中ACE抑制率和pH值的变化Fig.1 Time courses of ACE inhibitory rate and pH during SPI fermentation by different Lactobacillus strains

图 2 5种乳酸菌ACE抑制率与肽含量的比较Fig.2 Effect of different Lactobacillus strains on ACE inhibitory rate and peptide concentration before and after fermentation

2.2 霉菌发酵大豆蛋白结果

分别将3株霉菌在最佳菌龄时以5%的接种量接种到大豆蛋白溶液中，30℃发酵48h。由图3可知，随着发酵时间的增加，3株霉菌发酵液的ACE抑制率均呈上升趋势，在发酵48h达到最大，而pH值基本处于稳定状态，保持在7.1左右，且有先升高后降低的微小趋势。由图4可知，米曲霉的ACE抑制率和肽含量最高，分别为41.23%和2.17mg/mL。原因可能是霉菌发酵产酸性、中性和碱性3种蛋白酶，其中米曲霉以产中性蛋白酶和碱性蛋白酶为主，只产生很少量的酸性蛋白酶[12-13]。随着发酵时间的延长，微生物分解大豆分离蛋白产生碱(氨或胺类)，导致发酵液的pH值升高，并适合碱性蛋白酶的作用条件，有利于米曲霉发酵释放ACE抑制肽[14]。

图 3 不同霉菌发酵过程中ACE抑制率和pH值的变化Fig.3 Time courses of ACE inhibitory rate and pH during SPI fermentation by different mould strains

图 4 3种霉菌ACE抑制率与肽含量的比较Fig.4 Effect of different mould strains on ACE inhibitory rate and peptide concentration before and after fermentation

2.3 枯草芽孢杆菌发酵大豆蛋白结果

图 5 枯草芽孢杆菌发酵过程中ACE抑制率、肽含量和pH值的变化Fig.5 Effect of Bacillus subtilis fermentation on ACE inhibitory rate and peptide concentration

将枯草芽孢杆菌在最佳菌龄时以5%的接种量接种到大豆蛋白溶液中，30℃发酵40h，发酵结果见图5。可知，随着发酵时间的延长，发酵液中的ACE抑制率呈先上升后降低的趋势，发酵30h时达到最大，此时ACE抑制率达到45.02%。发酵后测得的肽含量为2.25mg/mL，且发酵前后发酵液中肽含量明显增加。姜瞻梅等[15]研究表明，随着发酵时间的延长，发酵液pH值呈先下降后增加的趋势，与本实验的结果一致。在整个发酵进程中，可能是发酵初期菌体迅速分解利用葡萄糖，使得产酸大于产碱，导致pH值下降；随着发酵时间的延长，大豆蛋白开始被利用，菌体代谢中产生更多的是碱性类氮源分解物(如氨等)，从而导致pH值上升。

2.4 具有ACE抑制活性最佳菌株的确定

表 1 9种菌株的筛选结果Table 1 Results of screening 9 strains for microbial preparation of ACE inhibitory peptides from SPI

由表1可知，乳酸菌KLDS 1.0201、KLDS 1.0205、KLDS 4.0303和嗜热链球菌的最佳发酵时间是24h，保加利亚乳杆菌与枯草芽孢杆菌的最佳发酵时间是30h，霉菌的最佳发酵时间为48h。保加利亚乳杆菌的ACE抑制率和肽含量均较其他菌株高，分别为57.93%和3.27mg/mL，且发酵时间相对较短，是制备ACE抑制肽的最佳菌株。还发现在所有菌株中，ACE抑制率高的菌株其肽含量也较高，可推断ACE抑制活性与肽含量之间具有一定的正相关性。

3 结 论

乳酸菌、霉菌和枯草芽孢杆菌均具有ACE抑制活性，乳酸菌中具有强ACE抑制活性的菌株为保加利亚乳杆菌，ACE抑制率和肽含量分别为57.93%和3.27mg/mL；霉菌中具有强ACE抑制活性的菌株为米曲霉，ACE抑制率和肽含量为41.23%和2.17mg/mL；枯草芽孢杆菌的ACE抑制率和肽含量分别为45.02%和2.25mg/mL。所有菌株中，保加利亚乳杆菌发酵大豆蛋白结果测得的ACE抑制活性最高，显著高于其他菌株，且发酵时间较短。在乳酸菌发酵分析中发现，发酵液具有凝乳特性，且在凝乳后ACE抑制率明显增加，可推断乳酸菌发酵凝乳后能够促进ACE抑制肽的释放。实验还发现所有菌株发酵前后，发酵液中的肽含量增加，ACE抑制活性也增强，说明ACE抑制活性与肽含量之间具有一定的正相关性。综合比较9种菌株的发酵特性，选用保加利亚乳杆菌作为制备大豆ACE抑制肽的优良菌株。

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Screening of Optimal Strain for Microbial Preparation of ACE Inhibitory Peptides from Soybean Protein Isolate

LI Xiang，LIU Chang，WU Fei*
(College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

To screen the optimal strain for microbial preparation of ACE inhibitory peptides from soybean protein isolate (SPI), the effects of different strains including 5 Lactobacillus strains, 3 mould strains and 1 Bacillus subtilis strain on ACE inhibitory rate and peptide concentration were investigated. Lactobacillus bulgaricus was found to be the best of five 5 Lactobacillus strains for the preparation of ACE inhibitory peptides from SPI, providing an ACE inhibitory rate of 57.93% and a peptide concentration of 3.27 mg/mL. A. oryzae was the best mould, providing an ACE inhibitory rate of 41.23% and a peptide concentration of 2.17 mg/mL. Bacillus subtilis fermented SPI showed an ACE inhibitory rate of 45.02% and a peptide concentration of 2.25 mg/mL. Comparing the fermentation characteristics of 9 strains, Lactobacillus bulgaricus was an excellent strain for the preparation of ACE inhibitory peptides from SPI.

microbial fermentation；ACE inhibitory peptides；soybean protein；ACE inhibitory activity

TS214.2

A

1002-6630(2013)01-0185-04

2011-10-18

黑龙江省自然科学基金项目(C200942)

李响(1987ü)，女，硕士研究生，研究方向为食品科学。E-mail：dream9645@sina.com

*通信作者：吴非(1968ü)，女，教授，博士，研究方向为大豆产品精深加工。E-mail：wfneau@163.com