腊八蒜色素中间体——吡咯基氨基酸的抑菌作用

王 丹，赵广华，赵晓燕,*

(1. 北京市农林科学院蔬菜研究中心，农业部华北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，

农业部都市农业(北方)重点实验室，北京 100097；2.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083)

腊八蒜是我国传统的蒜制品，绿色素是其呈色物质。近年来研究表明大蒜绿色素形成的中间体为吡咯基氨基酸类物质，其与丙酮酸反应生成黄色素，与烯丙基硫代亚磺酸酯反应生成蓝色素[1-3]。这些色素形成的反应均为非酶反应，消耗的较慢，色素中间体在腊八蒜的产品中始终存在[4]，因此对其进行生物活性评价，能够增加大蒜的附加值。

醋大蒜比鲜蒜的抑菌作用更稳定，醋蒜的醇提物及醋蒜浸泡液均具有较好的抑菌活性[5]。此外，色素提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌及酿酒酵母菌也有一定的抗菌活性，其中对大肠杆菌的抑菌效果最好，对枯草芽孢杆菌的抑菌效果最弱，蒜醋使高胆固醇饲养的大鼠体质量明显下降，血液中的甘油三酸酯的含量降低[6-11]。然而目前主要研究了醋蒜及色素提取物的活性，此外前期的研究表明色素中间体不仅是色素形成的关键物质，还具有清除DPPH自由基、ABTS＋·的作用[12]，并且色素中间体的结构如吡咯基甘氨酸与苯甲酸相似(图1)，苯甲酸是目前常用的很好的防腐剂，从结构上分析具有抑菌的可能性，然而其抑菌性如何，未见文献报道。本实验主要对其抑菌活性进行研究，并研究4种腊八蒜色素中间体——吡咯基甘氨酸(P-Gly)、吡咯基丙氨酸(P-Ala)、吡咯基缬氨酸(P-Val)、吡咯基亮氨酸(P-Leu)抑制枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的能力，以期为腊八蒜保健功能的验证提供理论依据，增加其附加值。

图 1 色素中间体——吡咯基氨基酸及苯甲酸的结构Fig.1 Structures of four pyrrolyl amino acids and benzoic acid

1 材料与方法

1.1 菌种与培养基

大肠杆菌及枯草芽孢杆菌 中国科学院微生物菌种保藏中心。

营养琼脂培养基 北京奥博星生物科技有限公司。

1.2 试剂与仪器

甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸(均为分析纯)北京欣经科试剂公司；2,5-二甲氧基四氢呋喃(色谱纯)美国Fluka公司；冰醋酸、盐酸、无水乙酸钠、无水硫酸钠、氢氧化钾、乙酸乙酯、活性碳(分析纯) 北京化学试剂公司.

85-2型恒温磁力搅拌器 上海司乐仪器有限公司；868型pH计 美国奥立龙公司；SENCO R-501旋转蒸发仪 上海申顺生物科技有限公司；Carry 50紫外-可见分光光度计 美国瓦里安公司；DHP-9082型电热恒温培养箱 上海一恒科技有限公司；SW-CJ-1FD型无菌操作台 苏州尚田洁净技术有限公司；ZDX-35BI型自动电热压力蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂。

1.3 方法

1.3.1 微生物标准曲线的绘制及菌悬液的制备

标准曲线的绘制：无菌操作下降斜面保藏的枯草芽孢杆菌、大肠杆菌接种于已制好灭菌过的营养琼脂斜面上，接种后于37℃培养箱培养24h，连续培养两代。制备0.85%的无菌生理盐水，在无菌操作下将已经活化2次的枯草芽孢杆菌、大肠杆菌洗下，振荡使菌体分布均匀。采用平板菌落计数法计数细菌，计算出原菌液的菌体浓度，在此基础上稀释合适的倍数，测定各浓度对应的OD560nm值。以不同稀释度的菌落数为纵坐标，OD560nm值为横坐标做曲线，枯草芽孢杆菌：y=641.1x+3.9(R2=0.98)，大肠杆菌：y=284.9x+18.6(R2=0.97)。

菌悬液的制备：测定菌悬液的OD560nm，并在标准曲线上找出相应的菌浓后，用0.85%的生理盐水稀释该菌悬液，调节至一定菌浓。

1.3.2 色素中间体——吡咯基氨基酸的制备

[12-16]方法，本实验室自制4种色素中间体：吡咯基甘氨酸、吡咯基丙氨酸、吡咯基缬氨酸及吡咯基亮氨酸。具体如下：100mL冰乙酸中溶解10g无水乙酸钠，加入甘氨酸(0.0544mol)，溶解后加入2,5-二甲氧基四氢呋喃(0.0544mol)回流40min，降到室温，加500mL冰水，过滤，活性炭脱色。乙酸乙酯萃取，旋转蒸发。10g/100mL氢氧化钾溶解浓缩液，用2mol/L的盐酸调pH值到1～2，0～4℃条件下过夜，过滤，滤液用乙酸乙酯萃取，加入无水硫酸钠静置10h去除水分，旋转蒸干，所得物质即为吡咯基甘氨酸。除了原料采用相应的氨基酸外，吡咯基丙氨酸、吡咯基缬氨酸与吡咯基甘氨酸合成步骤相同。吡咯基亮氨酸在用2mol/L的盐酸调pH值到1～2时，出现油状液滴，收集即为吡咯基亮氨酸。

1.3.3 抑菌实验

大肠杆菌及枯草芽孢杆菌配制106的菌悬液，接种于营养琼脂培养基，待培养基凝固，在培养皿上放置牛津杯，每个牛津杯中加入20μL不同浓度的吡咯基氨基酸(10、20、30、40mmol/L)，在37℃培养箱培养24h，测量抑菌圈直径大小。

2 结果与分析

2.1 吡咯基氨基酸抑制枯草芽孢杆菌的能力

不同浓度吡咯基甘氨酸(10、20、30、40mmol/L)抑制枯草芽孢杆菌的结果见图1，其中纵坐标是抑菌圈的直径，直径越大说明抑菌的能力越强。

图 2 不同浓度吡咯基甘氨酸抑制枯草芽孢杆菌的能力Fig.2 Inhibitory activity of P-Gly at different concentrations against Bacillus subtilis

由图2可见，吡咯基甘氨酸具有一定的抑制枯草芽孢杆菌的能力，10mmol/L时就能体现一定的抑菌性，且浓度越大抑菌能力越强。其他的吡咯基氨基酸与吡咯基甘氨酸一样，也具有一定的抑制枯草芽孢杆菌的能力(结果未列出)。

不同的吡咯基氨基酸具有不同的极性及结构，为研究其抑菌能力的差异，本研究以苯甲酸作为对照，进一步比较了以上4种吡咯基氨基酸的抑制枯草芽孢杆菌的能力。相同浓度(20mmol/L)的不同吡咯基氨基酸抑制枯草芽孢杆菌能力的比较见图3。

图 3 不同吡咯基氨基酸抑制枯草芽孢杆菌的能力Fig.3 Inhibitory activity of four pyrrolyl amino acids against Bacillus subtilis

由图3可知，所有样品均有一定的抑制枯草芽孢杆菌的能力，其中吡咯基亮氨酸抑菌能力最强，其次是吡咯基甘氨酸，此两种物质较苯甲酸的抑菌能力更强，吡咯基丙氨酸的抑菌能力与苯甲酸相当，吡咯基缬氨酸的抑菌能力相对苯甲酸较差。

苯甲酸的抑菌机理是它的分子能抑制微生物细胞呼吸酶系统活性，特别是对乙酰酶缩合反应有很强的抑制作用。在高酸性食品中杀菌效力为微碱性食品的100倍，苯甲酸以未被解离的分子态才有防腐效果，可见pH值对抑菌的效果具有重要影响。苯甲酸抗菌有效性的最适pH值在2.5～4.0之间，pH值为3.5时，0.125%的溶液在1h内可杀死金黄色葡萄球菌和其他菌；然而pH值为5时，即使5%的浓度溶液杀菌效果也不可靠，由此可见pH值是影响某些防腐剂抑菌效果的重要因素。

根据前期的研究方法，采用标定法测定pKa值。将4种吡咯基氨基酸分别配制成不同的浓度，25℃测定其pKa值，可求得一系列的值，取其平均值，即为该温度条件下的pKa。吡咯基甘氨酸、吡咯基丙氨酸、吡咯基缬氨酸、吡咯基亮氨酸的pKa值见表1。所有吡咯基氨基酸均为一元弱酸，可以看成是乙酸的类似物。由表1可知，这些化合物的pKa值在3.45～3.91之间，比乙酸(4.75)低，表明其酸性比乙酸强。且此4种化合物的pKa值大小顺序为吡咯基亮氨酸(3.45)＜吡咯基甘氨酸(3.55)＜吡咯基丙氨酸(3.65)＜吡咯基缬氨酸(3.91)，观察规律发现此顺序正好与4种化合物的抑制枯草芽孢杆菌强弱的顺序相反：吡咯基亮氨酸＞吡咯基甘氨酸＞吡咯基丙氨酸＞吡咯基缬氨酸。可见pKa值越低抑制枯草芽孢杆菌的能力越强。

表 1 吡咯基氨基酸的pKa值Table 1 pKa values of four pyrrolyl amino acids

2.2 吡咯基氨基酸抑制大肠杆菌的能力

图 4 不同浓度吡咯基甘氨酸抑制大肠杆菌的能力Fig.4 Inhibitory activity of P-Gly at different concentrations against Escherichia coli

由图4可知，高浓度的吡咯基甘氨酸具有一定的抑制大肠杆菌的能力，10mmol/L的浓度不能抑制大肠杆菌(结果未显示)。与枯草芽孢杆菌相比，抑制大肠杆菌能力较小。进一步研究其他色素中间体抑制大肠杆菌的情况。

图 5 不同吡咯基氨基酸抑制大肠杆菌的能力Fig.5 Inhibitory activity of four pyrrolyl amino acids against Escherichia coli

图5为浓度20mmol/L的不同结构的色素中间体抑制大肠杆菌的情况，由此可知，吡咯基亮氨酸同样具有最强的抑菌能力，然而其他3种化合物的抑制大肠杆菌能力与抑制枯草芽孢杆菌的能力不同，吡咯基缬氨酸的抑菌能力增强，吡咯基丙氨酸与吡咯基甘氨酸的抑菌能力没有显著差异。可见抑制大肠杆菌的能力与其pKa值没有相关性。然而由结果可见，色素中间体的侧链结构越大(吡咯基亮氨酸＞吡咯基缬氨酸＞吡咯基丙氨酸＞吡咯基甘氨酸)，极性越弱，抑制大肠杆菌的能力越强(吡咯基亮氨酸＞吡咯基缬氨酸＞吡咯基丙氨酸≈吡咯基甘氨酸)。可能是由于色素中间体的侧链结构越大，脂溶性越强，与细菌细胞膜中磷脂分子和脂多糖等成分互作的能力越强，破坏膜稳定，从而抑制细菌生长的能力越强[17]。由此可见色素中间体抑制细菌的能力与其pKa值和结构的脂溶性程度有关，因为大肠杆菌为革兰氏阴性菌，细胞壁比较复杂，但肽聚糖层薄，较为脆弱，因此色素中间体的结构(脂溶性)对其抑菌影响较大，而枯草芽孢杆菌是革兰氏阳性菌，细胞壁肽聚糖层较厚，使其细胞壁机械强度强而饱满，因此，色素中间体的pKa值对其抑菌影响更大。

3 结 论

腊八蒜色素中间体具有一定的抑制枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的能力；此中间体抑制枯草芽孢杆菌的能力强于大肠杆菌；色素中间体的侧链结构和pKa值影响其抑菌能力，其中，pKa值是影响其抑制枯草芽孢杆菌的主要因素，而侧链结构是影响其抑制大肠杆菌的主要因素。

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