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半连续发酵及其应用研究进展

2013-04-09孙文敬刘长峰周延政王大明崔凤杰

食品科学 2013年1期
关键词:补料菌体醋酸

孙文敬,刘长峰,周延政,王大明,崔凤杰,余 琳

(1.江苏大学食品与生物工程学院,江苏 镇江 212013;2.江西省生物发酵食品添加剂工程技术研究中心,江西 德兴 334221;3.百勤异VC钠有限公司,江西 德兴 334221;4.河北师范大学生命科学学院,河北 石家庄 050016)

半连续发酵及其应用研究进展

孙文敬1,2,刘长峰1,2,周延政2,3,王大明4,崔凤杰1,2,余 琳1,2

(1.江苏大学食品与生物工程学院,江苏 镇江 212013;2.江西省生物发酵食品添加剂工程技术研究中心,江西 德兴 334221;3.百勤异VC钠有限公司,江西 德兴 334221;4.河北师范大学生命科学学院,河北 石家庄 050016)

半连续发酵是一种重要的生化培养方式。本文介绍半连续发酵的应用领域,详细综述半连续发酵的分类、特点、与连续发酵的联系以及半连续发酵过程中的菌体循环利用方法,并结合当前代谢工程和过程控制策略的发展趋势,对半连续发酵技术的应用前景进行展望。

半连续发酵;研究现状;应用领域;展望

半连续发酵(semi-continuous fermentation),又称半连续培养、反复分批培养或换液培养,是指在分批培养的基础上,周期性地放出部分含有产物的发酵液,然后再补加相同体积的新鲜培养基的发酵方法。在实施半连续发酵的操作过程中,补充了新营养成分的反应体系的培养条件与分批培养条件相同,且反应器内培养液的总体积基本保持不变[1]。半连续培养技术已在工业生产领域逐步得到应用,但与其相关的整合性论述却很少。本文主要综述半连续发酵过程以及操作工艺的国内外研究现状,以期为该工艺更广泛的应用提供参考。

1 半连续发酵的应用范围

半连续发酵技术在工业生产和科学研究中已经得到了比较广泛的应用,主要涉及菌体的生产、微生物代谢产物的生产、垃圾的厌氧消化和动物消化道内微生物的体外培养。

1.1 菌体的生产

对于部分微藻的培养,无论是在规模化生产中还是在实验室研究中,半连续培养模式都是常用的模式之一[2-5]。在微藻的半连续培养过程中,培养液的更新率对菌体生长和细胞内生化组分都有重要影响,是一个比较关键的参数[6]。

1.2 微生物代谢产物的生产

应用半连续培养工艺规模化生产微生物代谢产物的实例主要有:醋酸、青霉素和酒精。

1.2.1 醋酸

采用深层液体发酵工艺生产醋酸,醋酸的生成速率主要取决于醋酸菌的生长速率和活菌体浓度[7]。在连续培养体系中,由于醋酸菌的比生长速率较低以及环境中高浓度醋酸的存在,导致了比产物生成速率较低,因此高产酸率和高浓度的醋酸发酵不宜采用连续发酵工艺[7]。在醋酸的规模化生产中,目前广泛采用的是半连续发酵工艺[8]。以德国Heinrich Frings公司为例,其醋酸生产的基本工艺流程如下:当发酵进行至乙醇质量浓度接近于0时,放出40%的发酵液,然后加入等体积的新鲜酒醪进行再发酵,并保持整个发酵过程中通气和温度的恒定,醋酸的质量浓度可以达到13.3g/100mL。如果新鲜酒醪的添加方式正确和放罐时机掌握恰当,能够有效缩短下个周期发酵的延滞期,直接进入对数生长期[7]。

有关多级半连续发酵、发酵过程的控制和耐高浓度醋酸菌种的应用等相关研究[9-11]也有报道,其主要目的在于进一步提高发酵液中的产物浓度。

1.2.2 青霉素

青霉素被发现后的数10年间,该产品的生产技术得到了迅猛发展[12]。最初的青霉素半连续发酵生产纯粹是依据经验进行控制的[13],但对于这样一个时变性和非线性的复杂发酵过程,仅仅依靠经验进行控制不能满足现代化生产的要求[14],为此许多学者致力于实现青霉素半连续发酵过程的模型化及在此基础上实行的优化控制研究[15-17]。

发酵动力学研究表明,比生长速率为0.015h-1时青霉素生产菌的生产能力最强。该研究结果应用于工业生产中,就形成了目前青霉素发酵工业中普遍采用的半连续流加发酵工艺,我国工业界通俗地称其为青霉素发酵带放工艺[18]。

青霉素半连续发酵工艺的大致操作为:达到发酵终点时,放出20%~40%的发酵液进入后续的提取工艺,同时补充相同体积的新鲜培养基继续进行发酵,这种操作可以反复进行多次而不会导致产量减少,还能增加发酵罐的体积利用率[19]。徐猛[20]报道了另一种半连续发酵生产青霉素的方法,即将青霉素半连续发酵过程中带放的发酵液,通过管道转移到另一个无菌发酵罐中进行补料再培养,直至青霉菌进入自溶阶段。该方法充分利用了处于稳定期青霉菌的次级代谢能力,明显缩短了生产周期,有效降低了生产成本。

1.2.3 酒精

酒精的规模化生产目前主要采用连续浓醪发酵工艺,尤其是年产几十万吨的大型生产企业。一般在4~6级连续发酵工艺中,通过减少整体返混的方式来缓解产物抑制[21]。有关采用半连续发酵工艺生产酒精的研究也有报道,如刘晓峰等[22]在特大型发酵罐生产酒精的过程中,从设备投资和杂菌污染控制等方面对连续发酵工艺与半连续发酵工艺进行了比较,得出了在特大型发酵罐中采用半连续发酵工艺生产酒精更为合理的结论。表华伟[23]认为,半连续发酵生产酒精,一方面相对于分批发酵而言提高了设备利用率,缩短了发酵周期;另一方面为将来的连续发酵生产酒精打下了基础,以便整个酒精生产流程实现自动化控制。岳国君等[24]对酒精的生产技术做过评述,认为国外企业在生产酒精的过程中,通过将多级连续发酵工艺、同步糖化发酵工艺以及酵母的自絮凝技术相结合,显著降低了成本,优于国内企业多采用的半连续发酵工艺。

除醋酸、青霉素和酒精之外,尚有许多微生物代谢产物已在实验室规模上实现了半连续发酵生产,其生产效率远高于现有的分批发酵或补料分批发酵模式,如乳酸[25]、富马酸[26]、甘油[27]、脂肪酶[28]、二羟丙酮[29-30]等。对于这些代谢产物,实际生产过程中是否采用半连续发酵工艺应结合具体情况综合考虑。John等[31]对以工农业废物为原材料的乳酸发酵生产进行过评述:除了生产强度外,在其他技术指标上分批发酵工艺均优于连续发酵工艺;相对于分批发酵工艺而言,采用半连续发酵工艺可进一步提高发酵产率。因此,在原材料成本相对较高的情况下,应采用半连续发酵工艺使产率最大化;在设备及能耗成本相对较高的情况下,应采用连续发酵工艺使生产强度最大化。

1.3 垃圾的厌氧消化

垃圾的厌氧消化是指在厌氧微生物的作用下,垃圾中的有机物发生降解并趋于稳定的过程,该过程由水解产酸阶段和厌氧发酵产气阶段组成[32]。目前,垃圾的厌氧生物处理方式较多,其中也包括半连续操作模式,如Wang等[33]分别在实验室规模和实际生产规模中,对分批操作模式和半连续操作模式下甲烷的生产强度和挥发性固体的转移量进行了比较。由于半连续操作模式下污泥的稳定性更高,因此其生产效率相对高于分批操作模式。Kearney等[34]研究了半连续厌氧消化过程中大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌等几种菌的活性,为高效进行厌氧消化提供了一定的参考。李来庆等[35]建立了番茄废物半连续厌氧消化的动力学模型,能够用于蔬菜废物半连续厌氧消化过程的参数优化,并可以为该项技术的工程应用提供一定的理论指导。

1.4 动物消化道内微生物的体外培养

早在20世纪50年代,国外就开展了利用体外系统模拟胃肠生态系统的相关研究。1963年,Rufener等[36]提出连续培养系统可以用于模拟瘤胃微生物系统;20世纪80年代以来,有报道[37-38]认为采用半连续培养系统模拟肠道微生物系统能够取得更好的效果。在研究肠道菌群对异型生物质毒性的解除作用过程中,Campbell等[37]认为连续培养与半连续培养的区别主要在于营养物添加和废物移除的方式不同,连续培养系统虽然能够提供相对恒定水平的营养物,使微生物保持在稳定的状态,但回肠内的流质却是以类似脉冲的方式进入大肠,半连续培养模式与之更为相似,因此更适合于肠道微生物生态系统的模拟。

2 半连续发酵的特点

微生物发酵可分为分批、补料分批、半连续、连续等多种模式。分批发酵的人力、物力消耗较大,每批发酵都需要进行装料、灭菌、接种、放料、清洗等操作,工序繁琐,发酵周期较长,生产效率较低;补料分批发酵虽可通过补料补充养分或前体的不足,但是由于有害代谢产物的不断积累,产物合成最终难免受到阻遏;连续发酵较分批发酵和补料分批发酵生产强度大大提高,但容易遭受杂菌的污染,菌种易退化,设备投资较大,且发酵产物浓度较低;半连续发酵过程中,通过放掉部分发酵液再补入新鲜培养基,不仅可以补充养分和前体,而且代谢有害物被稀释,从而有利于产物的继续合成[39]。半连续发酵工艺的应用可以起到缓解产物抑制和避免代谢副产物积累的作用,改善了微生物的培养环境,有助于保持菌体活力的稳定,这也使其在某些初级代谢产物的生产过程中得到了应用,如醋酸[8]、乙醇[22]和乳酸[25]等。

对于某些次级代谢产物如青霉素[40]、赤霉素[41]、环孢菌素[42]和洛伐他汀[43]等,其最高的生产速率仅在某些瞬态条件下才能达到。采用半连续发酵工艺不仅可以使这种瞬态条件反复出现,而且还可以提高设备的利用率,因此半连续发酵工艺在次级代谢产物的生产方面有着重要的应用[44]。

除适合于动物消化道内微生物的体外培养[37]外,半连续培养模式还能满足一些特殊微生物的培养要求。Manu等[45]在研究厌氧条件下污泥对靛类染料和偶氮染料废水的脱色作用时指出,水流停留时间对脱色效率有关键影响。相对于其他的操作方式,采用半连续操作方式可以同时达到更长的水流停留时间和更高浓度的生物量,因此该操作模式比较适合于污泥对染料废水的脱色。Tripathi等[46]在研究微藻对重金属的生物监控作用时指出,连续培养系统和半连续培养系统均接近于天然湖泊的环境,但连续培养系统需要有精密的设备且操作繁琐,因此半连续培养系统更适用于微藻对重金属敏感度的研究。

3 半连续发酵的类型

3.1 单级半连续发酵

单级半连续发酵具有操作简单和应用普遍的特点,但是它无法充分利用底物和菌体。Macias等[47]在醋酸的单级半连续发酵过程中,采用计算机模拟的方法,对不同的补料放料策略进行比较。研究结果表明对于高浓度醋酸的生产,在产物浓度达到指定值时补料放料更合适;其他情况下,在指定的时间下补料放料更合适。3.2 多级半连续发酵

鉴于单级半连续发酵往往无法充分利用底物和菌体,许多学者[48-50]尝试构建多级反应系统来提高底物的利用率和避免代谢产物或代谢副产物在后期影响菌体的活性。为了避免发酵后期菌体大量死亡并尽可能缩短发酵周期,董晋军等[48]采用了两级半连续发酵工艺进行琥珀酸的生产,生产强度达到2.38g/(Lgh),远远高于分批发酵和补料分批发酵的生产强度1.13、1.36g/(Lgh),取得了较好的效果。在两级半连续发酵生产二羟基丙酮的过程中,Bauer等[50]采用荧光原位杂交技术,研究了高浓度产物对菌体生长的抑制作用,并据此确定了两级半连续发酵工艺中一级罐的补料放料时机(二羟基丙酮质量浓度达到82g/L),建立了一种比较稳定高效的二羟基丙酮生产方法。

4 半连续发酵与连续发酵的联系

相对于分批发酵而言,半连续发酵与连续发酵都要通过放出一部分发酵液并补入一部分新鲜培养基的方式,使产物生成期均得到了延长;但补料和放料方式的不同,又导致了半连续发酵工艺与连续发酵工艺之间也存在一系列的差异。

Pirt[44]认为如果以流加的方式进行反复补料分批发酵,使整个培养系统达到拟稳态(比生长速率≈稀释率),那么培养液的体积、稀释率以及相关的参数都会出现周期性的变化。当反复补料分批发酵的周期趋近于无穷大、放料体积趋近于无穷小时,可以获得近似恒化培养的稳态,获得的产物浓度趋近但不超过恒化培养得到的浓度。由于恒化培养对化学环境要求严格,因此反复补料分批发酵在技术上更容易实现。

Fencl等[51]在培养产蛋白圆酵母菌体时,对半连续培养和连续培养这两种操作方式进行了比较。认为菌体的比生长速率越低,二者的区别会越小,如果半连续培养的补料的间隔时间非常短(例如几分钟),而菌体的世代时间比较长(例如1h以上),可以认为这两种操作方式几乎等同。假如两种工艺条件下酵母细胞的世代时间相同,则连续培养的稀释率将比半连续培养高10%~15%,因此也就更具有优势。除此之外,半连续培养过程中限制性底物浓度的波动对酵母菌体细胞的生理状态会产生不利影响。

5 半连续发酵过程中菌体的重复利用

在半连续发酵过程中,为了提高生产效率,可以反复利用有活力的菌体。反复利用菌体主要通过离心、膜分离和固定化细胞3种方式实现。

5.1 离心

离心是将菌体从发酵液中分离出来的一种常用方法。刘永强等[52]采用离心的方法,进行了酵母反复分批发酵生产甘油的研究。在12个批次的实验中,甘油的产量比较稳定。但Gledhill等[53]采用离心的方法进行溶脂念珠菌半连续发酵生产柠檬酸的实验时,发现生产强度随着发酵周期增多而逐渐降低,可能是由于菌体在离心过程和再悬浮过程中受到了伤害,从而导致其活性降低。

5.2 膜分离技术

利用膜技术回收菌体的研究由来已久。从理论上来说,根据菌体细胞大小、保持活性条件以及物料理化特性,可选择适合于回收微生物细胞的膜,在优化膜过程操作参数的基础上实现特定的目标[54]。一般认为,膜生物反应器的应用能够使发酵过程实现高菌体浓度和高生产效率[55]。因此,在一些微生物代谢产物如醋酸[56]、乳酸[57]和甘露醇[58]的半连续发酵研究中,利用了膜生物反应器。

大多数有机酸发酵的细胞循环利用都是通过超滤膜组件来实现的,由于膜的孔径较小和分离过程中的压力较高,很容易造成膜的污染并使菌体细胞受到伤害。因此,在允许的条件下,应尽量采用微滤膜组件以提高分离效果并降低分离过程对菌体的伤害[59]。利用膜生物反应器半连续发酵生产甘露醇的过程中,整个运行设备的死体积(或称空隙体积)和操作技术上的偏差可能导致生产强度降低,因此合理的过程设计和恰当的过滤时间至关重要[58]。近年来,利用新材料改善膜组件过滤效果已成为膜生物反应器领域的研究热点[60-61]。

对于膜生物反应器来说,良好的密闭性是避免发酵污染的基础[59]。除此之外,选择合适的膜组件也是至关重要的。在利用膜反应系统连续发酵生产琥珀酸的过程中,采用中空纤维膜组件无法避免杂菌的污染[62]。为了防止染菌,有必要采用能够耐受高温灭菌的膜组件(如陶瓷膜组件)以保证严格的无菌条件。

5.3 固定化细胞技术

菌体的重复利用还可以通过细胞的固定化来实现。利用固定化细胞进行红色素的半连续发酵生产,不仅可以使细胞生长维持在最低限度,同时可以使细胞内的酶活力得到最大限度的保护,从而达到了较高的生产强度[63]。但是,固定化细胞技术在生产中的应用仍存在一定的问题。在流化床反应器内利用多孔玻璃固定的吉利蒙假丝酵母进行木糖醇的半连续发酵生产时,其发酵过程中菌体浓度的不断增大和各种物质转移的障碍使比产物生成速率明显下降[64];在固定化酪丁酸梭菌连续发酵生产丁酸的过程中,后期产物浓度大幅下降可能是由固定化细胞的堵塞所引起的[65]。要解决这些问题,需要从细胞固定化的载体材料、细胞的生理性状、生产工艺等多个方面进行考虑[66-67]。

6 结 语

半连续发酵是一种重要的生化培养方式,在工业生产和科学研究中正逐步得到广泛应用。半连续发酵过程中,合理控制微生物代谢反应途径是最大程度合成目的产物的前提条件,补料与放料策略的优化是提高产量的关键手段,菌体的重复利用是提升清洁生产水平的重要环节。

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Recent Progress in Semi-continuous Fermentation and Its Application

SUN Wen-jing1,2,LIU Chang-feng1,2,ZHOU Yan-zheng2,3,WANG Da-ming4,CUI Feng-jie1,2,YU Lin1,2
(1. School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China;2. Jiangxi Provincial Engineering and Technology Center for Food Additives Bio-production, Dexing 334221, China;3. Parchn Sodium Isovitamin C Co. Ltd., Dexing 334221, China;4. College of Life Science, Hebei Normal University, Shijiazhuang 050016, China)

Semi-continuous fermentation technology is a typical operational model. In this article, we fi rst introduced the application areas of semi-continuous fermentation, and then reviewed the classification and features of semi-continuous fermentation, its relation to continuous fermentation, and the cell recycling methods during cultivation. Finally, the prospects of semi-continuous fermentation technology were also discussed according to the recent progress on metabolic engineering and process optimization.

semi-continuous fermentation;research progress;application area;prospects

TQ920.62

A

1002-6630(2013)01-0345-06

2011-11-03

江西省科技条件平台建设项目(2010DTZ01900);江西省创新能力建设项目(赣发改高技字[2012]361号);江西省优势科技创新团队计划项目(赣科发计字[2010]156号);江西省主要学科学术和技术带头人培养计划项目(2008DD00600);江苏大学科研启动基金项目(08JDG029)

孙文敬(1964ü),男,研究员,博士,研究方向为生物化工。E-mail:sunwenjing1919@163.com

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