酶解法在鸡蛋脱敏中的应用研究进展

龙彩云，熊江花，简 姗，程芬芬，杨安树,*，陈红兵

(1.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047；2.南昌大学中德联合研究院，江西 南昌 330047；3.江西省农业环境监测站，江西 南昌 330046)

酶解法在鸡蛋脱敏中的应用研究进展

龙彩云1,2，熊江花3，简 姗1,2，程芬芬1,2，杨安树1,2,*，陈红兵1,2

(1.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047；2.南昌大学中德联合研究院，江西 南昌 330047；3.江西省农业环境监测站，江西 南昌 330046)

鸡蛋是联合国粮农组织(FAO)认定的八大类主要过敏食品之一，选用合适的加工方法可以降低鸡蛋的致敏性，其中酶解法是最有效的方法。本文论述鸡蛋中的4种主要过敏原，并详细阐述酶解对鸡蛋中主要过敏原结构和致敏性的影响，以期为开发低致敏性或无致敏性蛋制品提供一定的科学依据。

鸡蛋；过敏原；酶解；结构；致敏性

鸡蛋营养丰富，含有大量的蛋白质、维生素及矿物质，而且蛋清蛋白质的氨基酸模式最接近于合成人体组织蛋白的氨基酸模式，生物价达95以上，吸收利用率也在99.6%以上，是理想的食物蛋白质[1]。同时，鸡蛋中的蛋清蛋白具有良好的功能特性如凝胶、发泡和乳化性等，使其成为食品工业中一种重要的加工原料[2]。但是鸡蛋又是联合国粮农组织(FAO)认定的八大类主要过敏食物之一[3]，其过敏发生率为1.6%～3.2%。鸡蛋过敏会导致过敏性皮肤炎、鼻炎、荨麻疹和哮喘等，严重时甚至危及生命。迄今为止，鸡蛋过敏尚无特效疗法，严格避免食用含鸡蛋的食物是过敏患者的最佳选择，但鸡蛋常作配料添加到许多食品中，完全避免食用鸡蛋很困难，对鸡蛋过敏程度低的患者来说，也不是最佳办法。因此，为了降低鸡蛋对过敏人群的危害，利用食品加工方法开发低致敏和无致敏的蛋制品加工原料显得非常迫切。

1 鸡蛋中主要过敏原

鸡蛋中的过敏原主要存在于蛋清中，蛋清含有超过24种不同的蛋白质，目前发现蛋清中主要的过敏原有4种：分别是卵类黏蛋白(OVM，Gal d1)、卵白蛋白(OVA，Gal d2)、卵转铁蛋白(OVT，Gal d3)和溶菌酶(Lys，Gal d4)[4]。另外，鸡蛋中的其他蛋白也可能是某些人群的过敏原，如核黄素结合蛋白、类黏蛋白、α-卵黄蛋白(α-livetin，Gal d5)和卵黄糖蛋白42(YGP42，Gal d6)[5-6]。

卵类黏蛋白约占蛋清蛋白总量的11%，是分子质量为28kD、等电点为4.1的糖蛋白。一个蛋白分子由186个氨基酸组成，含有9个二硫键和3个相互独立的结构域，其中第3个结构域的致敏性最强，其二级结构包括α-螺旋(26%)、β-折叠(46%)、β-转角(10%)和无规则卷曲(18%)[7]，卵类黏蛋白分子含有8个IgG表位和9个IgE表位[8]。卵类黏蛋白对酶处理和热处理相当稳定。

卵白蛋白是蛋清中的主要蛋白质，约占54%，分子质量为44.5kD，等电点为4.5，包含3%的糖基组分。它是由385个氨基酸组成的单一肽链，也是蛋清蛋白中唯一含有4个自由巯基的磷糖球蛋白，这些巯基都被埋藏在蛋白质的疏水核心部分[9]，其二级结构包括α-螺旋(41%)、β-折叠(34%)、β-转角(12%)和无规则卷曲(13%)[10]，三级结构高度组织化，卵白蛋白有5个不同的IgE结合表位，其中4个暴露于蛋白质表面[11]，其过敏原表位主要由位于β-折叠和β-转角内的疏水氨基酸组成，另外一个主要表位由单个α-螺旋组成[12]。卵白蛋白一般不耐热和酶消化，且其致敏性在蛋清过敏原中并不是最强。

卵转铁蛋白约占蛋清总蛋白的12%，分子质量为77.9kD，等电点为6.0。它是由686个氨基酸组成的单一肽链，也是能与铁离子结合的一种糖蛋白，一个蛋白分子包含15个二硫键，没有自由的巯基，含有2个结构域(N域和C域)。佟平[13]预测其二级结构包括α-螺旋(30.78%)、β-折叠(19.57%)、β-转角(7.23%)和无规则卷曲(42.41%)，并模拟出卵转铁蛋白的14个IgE结合表位以及3个兔源IgG结合表位，同时还有10个卵转铁蛋白IgG和IgE共同结合的表位。卵转铁蛋白在自由形态下具有抗菌活性。

溶菌酶约占蛋清总蛋白的3.5%，分子质量为14.3kD，等电点为10.7。它是由129个氨基酸组成的单一肽链，一个蛋白分子含有4个二硫键，没有自由的巯基[14]，成熟溶菌酶的基因编码130个氨基酸残基[15]，它的表位定位尚未得到详细阐述。溶菌酶化学性质非常稳定，pH值在1.2～11.3之间变化不会引起酶结构发生显著改变，遇热该蛋白也很稳定，但在碱性条件下热稳定性较差。

2 酶解对鸡蛋过敏原结构的影响

目前，可利用酶解、热处理、糖基化及发酵等加工方法降低鸡蛋致敏性，但选择哪种加工方法降低过敏食物致敏性时，还应考虑过敏食物的口感、品质和功能特性是否受到影响。在这些方法中，酶解被认为是降低食物致敏性最有效的方法。利用合适的蛋白酶水解过敏原，使其分子质量减小、结构变得简单、掩盖或消除过敏原表位，可以有效地降低食物的致敏性。这一作用过程可以分为两个方面：一是改变过敏原表位的三级结构，或者断裂一些化学键使之失去原有的活性，从而降低其过敏性；二是断裂酰胺键，减少过敏原的分子质量，从而降低致敏性[16]。

近年来，随着酶解降低过敏原研究的深入，酶已由早期最常用的动物蛋白酶(如猪胃蛋白酶和胰蛋白酶)发展为植物蛋白酶(如木瓜蛋白酶)和微生物蛋白酶(如风味蛋白酶)；在酶解模式上，由单酶水解发展为多酶水解，包括多酶同步水解和多酶分步水解。不同过敏食物经相同的酶解过程，其致敏性变化也可能不同，这与食品中蛋白质的组成和结构有关。酶解能改变蛋白质结构，酶水解过敏原时，蛋白质一级结构的变化导致线性表位的变化，而蛋白质构象的变化导致构象型表位的变化。因此，酶解降低过敏原致敏性的关键是过敏原结构(特别是过敏原表位)发生了变化。

蛋白水解酶可使蛋白质的一级结构发生变化，从而可能导致线性表位减少或消失，蛋白质致敏性降低。早期研究中，Kitabatake等[17]发现胃蛋白酶在pH4条件下限制性水解卵白蛋白的His22和Ala23之间的肽键。同样的，Martos等[18]以质谱分析鉴定卵白蛋白的胃蛋白酶水解物，结果表明胃蛋白酶可在His22和Ala23之间切断卵白蛋白。另外，Kovacs-Nolan等[19]用胃蛋白酶水解卵类黏蛋白后分离得到5个组分，通过氨基酸分析发现其中组分1是通过断裂该蛋白的第二和第三结构域间的肽键而得到，由第三结构域组成，组分2和5的氨基酸序列对应于第一结构域，它们包含了部分或全部的第一结构域，组分3包含了4个肽段，而组分4可能是组分1、2和5的混合物。

在通常的食品加工条件下，构象型表位一般比线性表位更易受到加工的影响。就酶解而言，不同表位受到的影响也不同，通常构象型表位在水解开始后会被迅速破坏。酶解过程中若蛋白质二硫键含量发生变化，则蛋白质结构可能改变，从而使过敏原构象型表位减少甚至消失。胃蛋白酶能够使蛋白质内部的二硫键暴露出来，有研究表明[20]，用胃蛋白酶处理的蛋清，暴露在蛋白表面的二硫键增多，蛋清蛋白的二级结构由α-螺旋为主变成以β-转角和无规则卷曲为主，抗原性有所降低，原因可能是由于胃蛋白酶暴露的二硫键隐藏了某些抗原表位。聂君等[21]发现蛋清经酶水解作用后能产生聚合型大蛋白，这可能是蛋白质二硫键的作用使小蛋白发生聚合，而过敏原通过二硫键发生聚合可能会隐藏一些表位，从而导致其抗原性降低。Martos等[18]发现卵白蛋白的二级结构在模拟胃液中只有微小变化，但是其三级结构几乎完全被破坏。Matsuda等[22]用圆二色谱分析卵类黏蛋白的胃消化产物，结果表明，随着消化时间延长，产物中二级结构含量逐渐减少。Jiménez-Saiz等[23]发现溶菌酶在模拟胃液中二级结构没有明显变化，这与Laureto等[24]研究的结果相符合。

3 酶解对鸡蛋致敏性的影响

有些个体接受过敏原刺激后能在体内产生相当量的IgE抗体，IgE具有亲细胞的特性，能与肥大细胞和嗜碱性粒细胞结合。当相应的过敏原作用于结合在这些细胞表面的IgE后，所形成的变应原-IgE复合物能激活这些细胞使之脱颗粒，释放多种生物活性物质，如组胺、激肽等，从而引起局部或全身过敏反应。但是，此阶段要求过敏原与这些细胞至少2个相邻近的IgE分子相结合，才能促使细胞脱颗粒[25]。众所周知，过敏原普遍具有抗降解性，食入后在胃肠内停留较长时间而不被消化分解，可以持续刺激胃肠黏膜免疫系统的相关淋巴细胞产生一定免疫反应。但是过敏原经酶解后，表位可能被破坏或形成单价的表位，从而不能促使细胞脱颗粒。因此，酶解能够很好地降低食物的过敏性。

近年来，国内外对乳制品、豆制品和海鲜类食品的酶水解研究较为深入，如Chicón等[26]在高压下用糜蛋白酶处理乳清蛋白，发现α-乳白蛋白与β-乳球蛋白均被水解成较大的疏水多肽，降低了乳清蛋白的抗原性及其与血清中IgE结合能力，减小了其潜在过敏性，可用于生产低致敏食品。Amigo-Benavent等[27]研究发现β-伴大豆球蛋白及其去糖基化的蛋白经过模拟胃肠消化后，免疫反应性均有显著降低，并且未检测到IgE结合表位。在蛋清蛋白方面，利用酶水解制备生物活性肽的研究较多，而借助酶水解降低其致敏性的研究则较少。有学者以不同的鸡蛋原料研究酶解对其致敏性的影响，包括鸡蛋或蛋清和已提纯的单一过敏原。

3.1 酶解鸡蛋或蛋清

国内外酶解鸡蛋或蛋清的研究较纯过敏原蛋白多。许多学者报道鸡蛋或蛋清经酶解后，其致敏性有所降低，如Sabine等[28]研究发现鸡蛋经不同温度加热处理和风味蛋白酶及复合蛋白酶水解后，其致敏性显著降低，同时能够很好地保留鸡蛋原有的风味和质构。Fritsche等[29]分别用碱性蛋白酶、风味蛋白酶和复合蛋白酶联合处理全蛋白液，抗原性和致敏性均显著降低，抑制了过敏反应。人体消化道中存在各种蛋白酶，食物中蛋白质的体内消化过程也包含了水解过程。Jiménez-Saiz等[30]探讨了乳化对鸡蛋消化性和致敏性的影响，结果表明，乳化未改变鸡蛋蛋白的IgE结合能力，但是与鸡蛋水溶液相比，鸡蛋乳化液经消化后得到的产物IgE结合能力降低更为显著，表明酶解鸡蛋乳化液得到的产物可能不会引起过敏反应。Martos等[31]模拟了蛋清、蛋黄和两者混合在体内的消化，研究发现：蛋黄经消化后的IgE免疫反应性最低，蛋黄能一定程度上促进蛋清的水解，但是不能显著改变其最终的IgE结合能力。在国内，聂君等[21]用不同的蛋白水解酶加工蛋清，结果发现除复合蛋白酶外，其余蛋白酶均有不同程度降低蛋清致敏性的效果，其中，菠萝蛋白酶水解后其致敏性残留最少，致敏性降低了79.63%，其次是中性蛋白酶和胃蛋白酶，降低了约57.4%。但是也有研究表明鸡蛋或蛋清经酶水解后仍然含有一些关键的过敏原表位，如Yang等[32]用曲霉属氨肽酶处理的蛋清水解物喂养鸡蛋过敏的小鼠以探讨该水解物对小鼠的免疫调节作用，结果表明，小鼠血清中组胺、特异性IgE和IgG含量均显著降低，并且脾脏细胞中IL-4和IFN-γ的产生受到抑制，此免疫调节作用归因于蛋清水解物中存在着关键表位。鸡蛋或蛋清酶解操作简单，与传统鸡蛋加工模式一致，也迎合人们的消费习惯，但鸡蛋或蛋清中成分复杂，不同成分，特别是其中各过敏原蛋白表位对酶的敏感度不同，因而通过酶解控制致敏性存在难度。

3.2 酶解单一过敏原蛋白

3.2.1 酶解卵白蛋白

目前，卵白蛋白作为模型抗原被广泛用于过敏研究中。Martos等[18]模拟了卵白蛋白在生理条件下的消化，研究发现经过胃蛋白酶水解后，卵白蛋白IgE免疫反应性降低不显著，经过胰酶水解后，IgE免疫反应性显著降低，但免疫印迹和间接ELISA分析表明：卵白蛋白消化产物仍保留着IgE结合表位。Dupont等[33]探讨了卵白蛋白分别在成人与婴幼儿消化模型中的酶解行为，结果表明，卵白蛋白在婴幼儿消化模型中被逐渐水解，但在成人消化模型中水解更为迅速，卵白蛋白经这两种消化模型的最终免疫反应性分别降至70.6%和21.1%。也有研究表明，适当的前处理使过敏原构象改变、结构展开，增加对酶的敏感性，促进过敏原酶解，有助于降低其致敏性，如Jiménez-Saiz等[34]研究了卵白蛋白分别通过热加工和糖基化处理，并经模拟消化后IgE的结合能力，结果发现经胃蛋白酶等水解后，蛋白的IgG和IgE结合能力均有不同程度的降低，与未经前处理的蛋白相比，热加工处理的卵白蛋白再经酶解后，其IgE结合能力显著降低；而糖基化处理因形成高聚物降低了酶的可及性，从而抑制了卵白蛋白的酶解，但经酶解后其IgE结合能力也会降低。Martos等[35]也证实了加热处理能够提高卵白蛋白的体外消化性，还发现消化后显著降低了该蛋白引发嗜碱性粒细胞活化作用和脱颗粒，从而抑制了过敏反应。López-Expósito等[36]在400MPa高压条件下用胃蛋白酶水解卵白蛋白，利用反相高效液相色谱-质谱分析水解过程和肽段鉴定，同时利用酶联免疫吸附实验检测肽段的致敏性，研究发现鸡蛋蛋白很快被胃蛋白酶水解，水解产生的大部分肽段只含有一个IgE 结合位点，其致敏性很低，过敏性人群长期食用这种水解蛋白，可产生免疫耐受，改善过敏体质，因而对过敏患者的免疫治疗具有重要意义。最近，Jiménez-Saiz等[37]报道将卵白蛋白转变成热稳定性更高的蛋白后，发现因其结构改变，该蛋白免疫反应性降低；这种蛋白较未处理的蛋白更抗酶解，尤其是抗胃蛋白酶酶解，但是这两种蛋白分别经胃肠消化后，IgE结合能力均有所降低，并没有显著差别。过敏原的过敏属性可被食物基质通过辅助刺激专门的肠道黏膜免疫系统或保护其不被消化所改变[38]。之后该课题组[39]进一步探讨了多糖对卵白蛋白酶解的影响，结果表明，在多糖存在下，卵白蛋白的免疫反应性和抗酶解能力均增强，并且与不含多糖的卵白蛋白相比，其胃肠消化产物的IgE结合能力降低效果较差，这可能归因于多糖与肽段的相互作用。上述文献的相关报道为进一步研究酶解降低卵白蛋白的致敏性提供了一定的帮助。

3.2.2 酶解卵类黏蛋白

卵类蛋白对胃蛋白酶稳定，研究表明胃蛋白酶只能破坏位于卵类黏蛋白71～75区域的过敏原表位[19]。早前Matsuda等[22]发现胃蛋白酶水解卵类黏蛋白的片段仍保留较高的抗原性和致敏性。随后，又有学者发现用胃蛋白酶水解卵类黏蛋白得到的主要片段因含有IgE表位仍能引起过敏反应。Ryu等[40]分别用各种蛋白酶水解卵类黏蛋白均未能有效地降低其抗原性和致敏性。因此，很多学者试图通过改变卵类黏蛋白结构以增加其消化性达到降低致敏性的目的。Kovacs-Nolan等[19]对羧甲基还原前后的卵类黏蛋白进行胃消化研究，结果表明未处理的卵类黏蛋白的消化片段与IgE结合能力均有降低，但是其中两片段仍有较高的致敏性，而经羧甲基还原后的卵类黏蛋白因其结构的破坏，IgE结合能力显著降低，再经胃消化30min后，致敏性消失，因此，羧甲基化被认为是一种能降低食物致敏性的新方法。Jiménez-Saiz等[34]将卵类黏蛋白分别进行热处理和糖基化处理，并比较了模拟消化前后IgE结合能力的变化，结果表明热处理明显降低了卵类黏蛋白的IgE结合能力，糖基化明显增加了其IgE结合能力，原因可能是形成了新的表位或葡萄糖有助于其识别IgE表位，并且还发现这两种加工处理对卵类黏蛋白的消化性没有影响，但是经过消化后IgE结合能力均显著降低。

在鸡蛋过敏原中，卵白蛋白为含量最高的过敏原，而卵类黏蛋白又是目前已知致敏性最强的蛋白，因此，针对这两种过敏蛋白的酶解研究较多，而有关其他过敏原的酶解研究则相对较少。Jiménez-Saiz等[23]探讨了溶菌酶在体外的消化行为，研究表明其胃肠消化产物的抗原性仍然较高，原因是体外模拟胃消化溶菌酶产生的多肽含有关键的过敏原表位，因此仍保留致敏性。Martos等[41]探讨了核黄素结合蛋白在体外的消化行为，结果表明该蛋白的水解主要发生在模拟胃消化阶段，其胃肠消化产物的IgE结合能力有所降低，但是仍然有较高的致敏性，因此，需要进一步寻求新的水解方法来降低其致敏性。

4 结 语

通过食品加工处理降低或消除鸡蛋致敏性是蛋制品工业发展中面临的机遇和挑战。鸡蛋蛋白经适宜的蛋白酶水解后，可有效降低其致敏性；同时，水解过敏原还可能产生具有免疫调节、抗氧化、降血压等生理功能的活性肽，并且可以在一定程度上改善其功能特性，这不仅能进一步提高蛋清蛋白的食用安全性，而且能拓宽其应用范围。

然而，在酶水解降低鸡蛋致敏性研究中，目前，常规的酶水解仍存在许多亟待解决的问题，主要表现在：1)蛋白酶解过程中，酶会产生自水解片段，干扰下游分析检测；2)酶水解过程复杂，酶解过敏原还可能使蛋白内部的致敏性表位暴露出来，导致产物的致敏性增强；3)酶专一性不高，导致原本用作水解过敏原的酶，更多地水解食品中其他蛋白成分，从而可能损失营养物质；4)酶与底物未充分接触，两者之间难以有效进行诱导契合的过程，从而影响酶解效果；5)酶水解(特别是过度水解)后大量疏水性基团的暴露，使得水解物带有苦腥味，严重影响食品的可食性。这些问题困扰并影响着酶解在降低鸡蛋过敏原性方面的研究和应用。因此，需对酶解过程中酶的种类、酶解模式、酶解程度、酶解产物等因素对鸡蛋致敏性及风味的影响机制进行深入研究，使其能更好地为酶解控制过敏原性和开发低致敏性的蛋制品提供理论依据。

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Application of Enzymatic Hydrolysis in Hypoallergenic Egg Products

LONG Cai-yun1,2，XIONG Jiang-hua3，JIAN Shan1,2，CHENG Fen-fen1,2，YANG An-shu1,2,*，CHEN Hong-bing1,2
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China；2. Sino-German Joint Research Institute, Nanchang University, Nanchang 330047, China；3. Jiangxi Province Agro-Environmental Monitoring Station, Nanchang 330046, China)

Hen’s egg is regarded as one of the eight major allergic foods by FAO, and the allergenicity can be reduced by proper processing, in which enzymatic hydrolysis is the most effective method. In this paper, four major allergens present in egg were described, and the impact of enzymatic hydrolysis on the structure and allergenicity of major allergens in egg were reviewed in detail. It offered the scientif i c basis for producing the hypoallergenic or non-allergenic egg products.

egg；allergen；enzymatic hydrolysis；structure；allergenicity

TS201.6

A

1002-6630(2013)01-0340-05

2012-07-08

江西省科技厅科技支撑计划项目(20111BBF60025)；十二五国家科技支撑计划项目(2011BAK10B03；2012BAK17B02)；国家自然科学基金项目(31060215)；南昌大学食品科学与技术国家重点实验室资助项目(SKLFQN-201111；SKLF-MB-201002；SKLF-TS-201109；SKLF-KF-201007)

龙彩云(1989ü)，女，硕士研究生，研究方向为生物化工。E-mail：lycaiyun@163.com

*通信作者：杨安树(1972ü)，男，副教授，博士，研究方向为食品科学。E-mail：yanganshuxjh@yahoo.com.cn