蔷薇科中药配方颗粒微生物限度检查法方法学研究

李趣嫦 钟燕飞 肖建光 苟 强

广东省食品药品检验所微生物室，广东 广州 510180

蔷薇科中药配方颗粒微生物限度检查法方法学研究

李趣嫦 钟燕飞 肖建光 苟 强

广东省食品药品检验所微生物室，广东 广州 510180

目的：建立蔷薇科8种代表性中药 （山楂、苦杏仁、桃仁、地榆、枇杷叶、木瓜、乌梅和金樱子）配方颗粒微生物限度检查法，并进行方法学验证。方法：采用平皿法和培养基稀释法。结果：其中5种 （山楂、苦杏仁、桃仁、木瓜和乌梅）中药配方颗粒可采用平皿法进行细菌、霉菌及酵母菌计数检查；另外3种 （地榆、枇杷叶和金樱子）可用培养基稀释法进行细菌计数、霉菌及酵母菌计数检查；控制菌均可用常规法检查。结论：蔷薇科中药配方颗粒多数无抑菌性，少数对个别菌谱的微生物有一定的抑菌性。

蔷薇科中药；配方颗粒；微生物限度；方法学验证

蔷薇科（Rosa multiflora）植物主要分布在北半球温带、亚热带及热带山区等地区，多种蔷薇科植物被2010年版《中国药典》药典收录［1］，常见的代表性蔷薇科中药有山楂、苦杏仁、桃仁、地榆、枇杷叶、木瓜、乌梅和金樱子等，这些蔷薇科中药在化学成分、药理及药效方面的研究非常广泛［2－9］，并有多种常见中药剂型，如单味的配方颗粒等。蔷薇科中药及制剂的微生物限度检测方法尚未见正式文献报道，2010年版 《中国药典》一部［1］要求，口服制剂应做微生物限度检查，并应对所用方法进行验证，以确定所采用的方法适合于该产品的微生物限度检查，保证能充分检出供试品中污染的微生物。本文建立了蔷薇科中8种代表性中药 （山楂、苦杏仁、桃仁、地榆、枇杷叶、木瓜、乌梅和金樱子）配方颗粒的微生物限度检查方法，采用5种标准菌株 （大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉），人工污染8种代表性的蔷薇科中药配方颗粒，并对各试验菌进行回收率试验，建立其微生物限度的检查方法，同时对方法学进行验证，为本蔷薇科中药材的抑菌性作科学研究，对其相应品种的微生物限度检查法的建立作有效的技术支撑。

1 仪器与试药

1.1 菌种 金黄色葡萄球菌［CMCC（B）26003］、大肠埃希菌［CMCC（B）44102］、枯草芽孢杆菌［CMCC（B）63501］和白色念珠菌［CMCC（F）10123］均购自中国药品生物制品检定所；黑曲霉（ATCC16404）购自于广东省微生物研究所。

1.2 培养基 营养琼脂培养基，玫瑰红钠琼脂培养基，营养肉汤培养基，改良马丁培养基，改良马丁琼脂培养基，胆盐乳糖培养基，MUG培养基，曙红亚甲蓝琼脂培养基。

1.3 供试品

华润三九医药股份有限公司苦杏仁配方颗粒 1007021S、1006281S、1006261S 华润三九医药股份有限公司桃仁配方颗粒 1006171S、1006131S、1006091S 华润三九医药股份有限公司地榆配方颗粒 1007221S、1007291S、1007261S 华润三九医药股份有限公司枇杷叶配方颗粒 1004281Z、1004271Z、1004231Z 华润三九医药股份有限公司木瓜配方颗粒 1203023、1203022、1111044 广东一方制药有限公司乌梅配方颗粒 1106100、1112046、1106101 广东一方制药有限公司金樱子配方颗粒 1111110、1111111、1108068生产厂家山楂配方颗粒 1111071S、1111081S、1111091S供试品名称 批号广东一方制药有限公司

2 方法与结果

2.1 菌液的制备

2.1.1 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌 取新鲜培养物接种至营养肉汤培养基中，置30～35℃培养18～24小时；培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液。用于控制菌验证时配制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液。

2.1.2 白色念珠菌 取新鲜培养物接种至改良马丁培养基中，置23～28℃培养24～48小时；培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液。

2.1.3 黑曲霉 取新鲜培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基中，置23～28℃培养5～7天，加入3～5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每lml含孢子数50～100cfu的孢子悬液。

2.2 供试液的制备 取样品10g，加入pH7.0的氯化钠－蛋白胨缓冲液至100m l，摇匀，制成1∶10供试液。

2.3 验证试验

2.3.1 试验组

2.3.1.1 平皿法 各取1∶10供试液1ml和试验菌液1ml，分别注入平皿中，立即倾注相应琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。

2.3.1.2 培养基稀释法 各取1∶10供试液0.5ml、0.2ml、0.1ml和试验菌液1ml，分别注入平皿中，立即倾注相应琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。

2.3.2 菌液组 取试验菌液1ml注入平皿中，立即倾注相应琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，测定所加的试验菌数。

2.3.3 供试品对照组 各取1∶10供试液1ml、0.5m l、0.2m l、0.1m l，按试验组操作，不加菌液，测定样品本底菌。

2.4 回收率试验

2.4.1 平皿法测定 蔷薇科8种中毒颗粒剂平皿法测定的回收率结果见表1。由表1可见，山楂、苦杏仁、桃仁、木瓜和乌梅5种供试品的5种菌株的回收率均高于70%，可采用平皿法进行细菌、霉菌及酵母菌计数。地榆的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌回收率低于70%，说明本品对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌有抑菌作用，细菌、霉菌及酵母菌检查不能采用平皿法检查。枇杷叶的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌回收率低于70%，说明本品对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌有抑菌作用，细菌检查不能用平皿法，而白色念珠菌、黑曲霉的回收率均高于70%，可采用平皿法进行霉菌及酵母菌计数。金樱子的金黄色葡萄球菌回收率低于70%，说明本品对金黄色葡萄球菌有抑菌作用，细菌检查不能用平皿法，而白色念珠菌、黑曲霉的回收率均高于70%，可采用平皿法进行霉菌及酵母菌计数。

2.4.2 培养基稀释法测定 枇杷叶和金樱子培养基稀释法测定的回收率结果见表2，地榆培养基稀释法测定的结果见表3。由表2可见，枇杷叶和金樱子采用培养基稀释法（0.5m l/皿）时，大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的回收率均高于70%，可采用培养基稀释法（0.5m l/皿）进行细菌计数。由表3可见，地榆采用培养基稀释法（0.1m l/皿）时，大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的回收率均高于70%，可采用培养基稀释法（0.1m l/皿）进行细菌计数检查；采用培养基稀释法 （0.2m l/皿）时，白色念珠菌、黑曲霉的回收率均高于70%，可采用培养基稀释法（0.2m l/皿）进行霉菌及酵母菌计数。

表1 蔷薇科8种中药颗粒剂平皿法的回收率 （%）

表2 枇杷叶和金樱子培养基稀释法的回收率 （%）

表3 地榆培养基稀释法的回收率 （%）

2.5 控制菌检查法的验证 配方颗粒作为口服制剂，按照《中国药典》2010年版［1］要求，微生物限度检查法还包括了控制菌大肠埃希菌的检查。

2.5.1 大肠埃希菌检查法的验证 取1∶10的供试液10m l及1m l大肠埃希菌菌液加至100ml的胆盐乳糖培养基中，按大肠埃希菌的检查法进行验证，结果见表4。由表4可见，所有供试品均可用常规法检查大肠埃希菌。

Development and Validation of a Microbial Limit Detection Method for Chinese formula Granules of Rosebus

Li Qu－chang，Zhong－Yan－fei，Xiao Jian－guang，Gou Qiang，Lin Li－ying
Guangdong Institute for Food and Drug Control，Guangzhou 510180，China

Objective：To develop and validate a method for microbial limit detection of 8 kinds of Chinese formula granules of Rosebush，i.e.hawthorn fruit，armeniaca amara，peach kernel，great burnet，folium eriobotryae，pawpaw，smoked plum and fructus rosae laevigatae.Methods：Routine method and culture medium diluted method were used in this study.Results：The bacteria，mold and yeast were counted by routine method for five kind of the Chinese formula granules（hawthorn fruit，armeniaca amara，peach kernel，pawpaw and smoked plum）and culture medium diluted method for three kind of other Chinese formula granules（great burnet，folium eriobotryae and fructus rosae laevigatae）；Control of bacteria were checked by routine test.Conclusion：Most species of the Chinese formula granules of Rosebush have not antibacterial activity while a few of them have certain inhibition on individual pathogens microorganism.

Rosebush；granules；microbial limit detection；method validation

R282.71

A

1007－8517（2013）09－0028－03

李趣嫦（1982－）女，学士，药师，研究方向：药物分析。E－mail：liquchang＠sohu.com。