MMPs激动剂和抑制剂对人巩膜成纤维细胞MMP-1/2以及Ⅰ型胶原表达的作用研究△

邹蕾蕾 刘睿 刘红 黄莉雯 周行 涛周浩

·基础研究·

MMPs激动剂和抑制剂对人巩膜成纤维细胞MMP-1/2以及Ⅰ型胶原表达的作用研究△

邹蕾蕾 刘睿 刘红 黄莉雯 周行 涛周浩

目的研究基质金属蛋白酶（MMPs）家族MMP-1、MMP-2激动剂和抑制剂对人巩膜Ⅰ型胶原表达的作用，探讨MMP-1和MMP-2在人巩膜胶原代谢中的作用。方法应用人巩膜成纤维细胞系作为研究模型，用荧光定量检测MMPs激动剂醋酸氨基苯汞（APMA）及抑制剂对人巩膜成纤维细胞MMP-1和MMP-2活性的影响；实时荧光定量反转录聚合酶链反应以及免疫印迹蛋白定量法检测比较激动剂组与抑制剂组对MMP-1/2以及Ⅰ型胶原mRNA和蛋白表达的变化；最后用siRNA干扰敲除MMP-1、MMP-2或MMP-1/2后，检测巩膜成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白水平的变化。结果MMPs激动剂引起MMP-1/2活性显著增加，Ⅰ型胶原mRNA和蛋白表达下降，MMPs抑制剂引起MMP-1/2活性显著下降，相应的Ⅰ型胶原mRNA和蛋白表达增加（均P＜0.01）。激动剂可引起MMP-1 mRNA表达增加（P＜0.01），对MMP-2 mRNA表达无明显影响（P＞0.05），而抑制剂能引起MMP-2 mRNA表达下降（P＜0.01），但对MMP-1 mRNA表达无显著影响（P＞0.05）。应用siRNA干扰方法敲除MMP-1、MMP-2或两者同时被敲除后，MMP-1蛋白表达均显著降低（均P＜0.01），MMP-2除在MMP-1 siRNA干扰敲除组无明显变化外（P＞0.05），其余各组均显著下降（均P＜0.01）；Ⅰ型胶原的表达在各敲除组中显著增加，当MMP-1和MMP-2均干扰敲除时，Ⅰ型胶原的表达增加最为显著（均P＜0.01）。结论在人巩膜成纤维细胞系中，MMP-1/2激动剂和抑制剂均能引起MMP-1/2活性改变及相应的MMP-1/2蛋白表达变化，并最终导致Ⅰ型胶原表达的变化；MMP-1和MMP-2是调控人巩膜Ⅰ型胶原重塑的关键因子。（中国眼耳鼻喉科杂志，2013，13：91-95）

人巩膜成纤维细胞；基质金属蛋白酶1；基质金属蛋白酶2；胶原，Ⅰ型

近视是由于眼轴异常延长所致。因此，明确近视眼眼轴延长的机制，是控制近视发生和发展的关键。大量研究［1-4］提示，巩膜的细胞外基质重塑以及生物力学方面的变化，可能导致眼轴增长，近视形成。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是一系列能降解多种大分子物质的酶，几乎能够降解除多糖以外的全部细胞外基质（extracellularmatrix，ECM）成分。目前研究［5-6］发现巩膜I型胶原改变与MMPs密切相关，其中MMP-1、MMP-2均可以降解Ⅰ型和Ⅱ型胶原。已发现人巩膜成纤维细胞上有MMP-1和MMP-2表达，然而尚无体外实验证明MMP-1、MMP-2激动剂和抑制剂对人巩膜成纤维细胞MMPs及Ⅰ型胶原表达的影响，因此本研究用人巩膜成纤维细胞系来研究MMP-1、MMP-2对Ⅰ型胶原的作用，应用siRNA干扰方法敲除MMP-1或MMP-2后，检测巩膜成纤维细胞Ⅰ型胶原mRNA和蛋白水平的变化，从而明确探讨MMP-1、MMP-2是否是引起人巩膜I型胶原降解的关键因子，为今后进一步阐明MMP-1和MMP-2在近视眼眼轴延长中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料及试剂 人巩膜成纤维细胞系（中国协和医科大学基础医学研究所）、β-actin（Santa Cruz公司，美国）、无水乙醇（溶于DEPC处理的水中）、Trizol试剂（Invitrogen公司，美国）、三蒸水（无RNA酶水）、羊抗兔IgG-HRP试剂盒（北京博奥森生物）、显影液（KODA公司，美国）、定影液（KODA公司，美国）、ECL发光试剂盒A、B液（武汉博士得公司）、MMP-1抑制剂Z-Pro-Leu-Gly-NHOH（ENZO公司，美国）、MMP-2抑制剂ARP-101（SIGMA-ALDRICH公司，美国）及MMPs激动剂（SIGMA公司，美国）等。

1.2 实验方法

1.2.1 检测激动剂及抑制剂对MMP-1/2活性的影响

（1）用荧光定量法检测MMPs激动剂醋酸氨基苯汞（P-aminophenylmercuric acetate，APMA）及MMP-1抑制剂对人巩膜成纤维细胞MMP-1活性的影响：将人巩膜成纤维细胞种在6孔培养板中，等细胞密度达到80％后，加入APMA（1 mmol/L）处理细胞2 h或Z-Pro-Leu-Gly-NHOH处理细胞18 h，裂解细胞，按试剂盒说明书测定MMP-1的活性。

（2）采用酶谱法检测APMA及MMP-2抑制剂对人巩膜成纤维细胞MMP-2活性的影响：将人巩膜成纤维细胞种在6孔培养板中，等细胞密度达到80％，加入APMA（1 mmol/L）处理细胞18 h或ARP-101处理细胞18 h，裂解细胞，按前述酶谱法测定MMP-2的活性。

1.2.2 测量MMP-1/2mRNA以及I型胶原mRNA的表达

（1）目的基因引物的合成：引物由上海基础实验中心合成。引物序列如下：β-actin的扩增大小148 bp，上游引物：5′GCACCCAGCCAATATAGGAC3′，下游引物：5′AGAATTGTCCCTTGGCCTCT3′；MMP-1扩增大小为354 bp，上游引物：5′AGGTTATCCCAAAATGA TAG3′，下游引物：5′TGCAGTTGAACCAGCTATTA3′；MMP-2扩增大小为90 bp，上游引物：5′TACAGG ATCATTGGCTACACACC3′，下游引物：5′GGTCACA TCGCTCCAGACT3′；胶原I扩增大小为125 bp，上游引物：5′GCACCTCTCACTCCATTACA3′，下游引物：5′AAATGAAAGTCAAGGGGAAC3′。

（2）Trizol法提取细胞总mRNA，RT试剂盒对总mRNA进行反转录，合成cDNA。

（3）实时荧光定量反转录聚合酶链反应（real-time reverse transcriptional polymerase chain reaction，RTPCR）：PCR反应液中，cDNA 0.5μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，SYBS green supermix 12.5 μL，去离子水6μL。把配制好的PCR反应液20μL置入200μL的灭菌离心管，迅速放入FeroTec Gradien PCR扩增仪，按扩增程序进行PCR扩增。

（4）将反转录得到的cDNA样本各取1μL，在相同反应条件下进行PCR扩增及检测荧光强度，自动绘制动力学曲线，判读其Ct值。采用比较阈值法计算待测样本中目的基因表达相对于校正样本的变化倍数。

1.2.3 检测MMP-1/2以及I型胶原蛋白的表达 免疫印迹蛋白定量（Western-blot）方法检测：收集细胞，用冷磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS）洗涤3次后，将细胞重悬于细胞裂解液中，冰浴6 min，使细胞充分裂解离心，收集上清液，分装冻存配置BCA工作液；分别吸25μL标准品，待测样品至微孔板对应孔中，每孔加入200μL BCA工作液，震荡6 s以彻底混合均匀。盖好微孔板，7℃孵育6 min，冷却至室温。测量各孔590 nm吸光度值，测得的每个标准孔和待测样品孔的吸光度值分别减去空白孔平均吸光度值。以校正过的BSA标准蛋白测量值对其浓度（mg/L）做图绘制标准曲线，使用标准曲线定量待测样品蛋白浓度，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳完毕后对凝胶进行半干转膜。转膜完毕取出PVDF膜，置于含50 mg/L脱脂奶粉的TTBS封闭液中，于室温封闭2 h与一抗结合，洗膜。二抗结合，抗体结合区带用化学发光法检测，信号强度用Bio 1D图像分析软件进行相对定量分析。

1.2.4 siRNA干扰 在人巩膜成纤维细胞转染合成的MMP-1 siRNA或MMP-2 siRNA以及对照siRNA，转染72 h后收集细胞，用免疫印迹蛋白定量检测MMP-1、MMP-2蛋白水平的变化，确证siRNA干扰的效果。

1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件对数据进行统计分析，各组数据结果以均数±标准差表示。凡对照组与实验组间差异分别行配对t检验，组间差异行完全随机单因素方差分析，组间两两比较采用Bonferroni法。方差不齐时，采用Games-Howell法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MMPs激动剂及抑制剂对人巩膜成纤维细胞MMP-1/2活性的影响 MMPs激动剂及抑制剂对人巩膜成纤维细胞MMP-1/2活性的影响（表1）显示，MMP-1激动剂组、抑制剂组及对照组之间相比，差异有统计学意义（F=534.328，P＜0.001）；和对照组相比，激动剂组MMP-1活性增高，抑制剂组MMP-1活性降低，差异有统计学意义（P＜0.001）。MMP-2激动剂组、抑制剂组及对照组之间相比，差异有统计学意义（F=250.628，P＜0.001）；和对照组相比，MMP-2激动剂组MMP-2活性增高，MMP-2抑制剂组MMP-1活性降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。

表1 MMPs激动剂及抑制剂对人巩膜成纤维细胞MMP-1/2的活性影响

2.2 MMPs激动剂及抑制剂对人巩膜成纤维细胞MMP-1/2及Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达的影响 MMPs激动剂及抑制剂对人巩膜成纤维细胞MMP-1/2及Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达（表2）显示：MMP-1激动剂组、MMP-1抑制剂组及对照组之间，MMP-1mRNA的相对表达量（2-ΔΔCt）比较差异有统计学意义（F=174.030，P＜0.001）；与对照组相比，MMP-1激动剂组MMP-1 mRNA的表达明显增多，差异有统计学意义（P= 0.009），但MMP-1抑制剂组与对照组相比，两组间MMP-1 mRNA表达差异无统计学意义（P=0.9）。MMP-1激动剂组、MMP-1抑制剂组及对照组之间，Ⅰ型胶原蛋白mRNA的相对表达量（2-ΔΔCt）比较差异有统计学意义（F=381.946，P＜0.001）；与对照组相比，MMP-1激动剂组Ⅰ型胶原蛋白mRNA的表达减少，差异有统计学意义（P=0.021），MMP-1抑制剂组Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达显著增加，差异有统计学意义（P=0.003）。

MMP-2激动剂组、MMP-2抑制剂组以及正常对照组MMP-2mRNA的相对表达量（2-ΔΔCt）之间，MMP-2 mRNA总体比较差异有统计学意义（F=126.924，P＜0.001）；与正常对照组相比，MMP-2抑制剂组MMP-2 mRNA表达显著减少（P＜0.001），但MMP-2激动剂组与之相比，MMP-2mRNA的表达无明显改变（P= 0.186）；MMP-2激动剂组、MMP-2抑制剂组以及正常对照组中Ⅰ型胶原蛋白mRNA相对表达量（2-ΔΔCt）之间，各组Ⅰ型胶原蛋白mRNA总体比较差异有统计学意义（F=69.815，P＜0.001）；与对照组相比，MMP-2激动剂组Ⅰ型胶原蛋白mRNA的表达显著减少（P= 0.003），MMP-2抑制剂组Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达显著增加（P=0.004）。

表2 MMPs激动剂及抑制剂对人巩膜成纤维细胞MMP-1/2及Ⅰ型胶原蛋白m RNA表达

2.3 MMPs激动剂及抑制剂对人巩膜成纤维细胞MMP-1/2及Ⅰ型胶原蛋白水平的影响 MMPs激动剂及抑制剂对人巩膜成纤维细胞MMP-1/2及Ⅰ型胶原蛋白水平（表3）示：MMP-1激动剂组，MMP-1抑制剂组以及对照组MMP-1表达总体比较差异有统计学意义（F=1062.700，P＜0.001）；与正常对照组相比，MMP-1激动剂组MMP-1表达明显增多（P＜0.001），而MMP-1抑制剂组MMP-1表达明显减少（P＜0.001）；MMP-1激动剂组，MMP-1抑制剂组以及正常对照组Ⅰ型胶原蛋白各组Ⅰ型胶原蛋白表达总体比较差异有统计学意义（F=1204.000，P＜0.001）；与对照组相比，MMP-1激动剂组Ⅰ型胶原蛋白表达显著减少（P＜0.001），而MMP-1抑制剂组Ⅰ型胶原蛋白表达显著增加（P＜0.001）。MMP-2激动剂组、MMP-2抑制剂组以及对照组MMP-2表达总体比较差异有统计学意义（F=295.125，P＜0.001）；与对照组相比，MMP-2激动剂组MMP-2表达明显增多（P＜0.001），而MMP-2抑制剂组MMP-2表达明显减少（P＜0.001）；APMA处理组，MMP-2抑制剂组以及正常对照组各组Ⅰ型胶原蛋白表达总体比较差异有统计学意义（F=567.000，P＜0.001）；与正常对照组相比，MMP-2激动剂组Ⅰ型胶原蛋白表达显著减少（P＜0.001），而MMP-2抑制剂组Ⅰ型胶原蛋白表达显著增加（P＜0.001）。

表3 MMPs激动剂及抑制剂对人巩膜成纤维细胞MMP-1/2及Ⅰ型胶原蛋白水平

2.4 siRNA干扰敲除MMPs后，巩膜成纤维细胞MMP-1/2和Ⅰ型胶原蛋白水平的变化 siRNA干扰敲除MMPs后，巩膜成纤维细胞MMP-1/2和Ⅰ型胶原蛋白水平（表4）示：对照组、MMP-1干扰敲除组、MMP-2干扰敲除组以及MMP-1联合MMP-2干扰敲除组中，各组MMP-1表达总体比较差异有统计学意义（F= 653.639，P＜0.001）；与对照组相比，其余各组MMP-1表达明显减少（P＜0.001），尤其以MMP-1干扰敲除组以及MMP-1联合MMP-2干扰敲除组MMP-1表达降低最为明显；对照组、MMP-1干扰敲除组、MMP-2干扰敲除组以及MMP-1联合MMP-2干扰敲除组中，各组MMP-2表达总体比较差异有统计学意义（F= 868.458，P＜0.001）；与正常对照组相比，MMP-2干扰敲除组以及MMP-1联合MMP-2干扰敲除组中MMP-2蛋白表达明显减少（P＜0.001），而MMP-1干扰敲除组中MMP-2蛋白表达无明显改变（P＞0.05）；对照组、MMP-1干扰敲除组、MMP-2干扰敲除组以及MMP-1联合MMP-2干扰敲除组中，各组Ⅰ型胶原蛋白表达总体比较差异有统计学意义（F=2298.210，P＜0.001）；与对照组相比，其余各组Ⅰ型胶原蛋白表达均明显升高（P＜0.001），其中MMP-1联合MMP-2干扰敲除组中Ⅰ型胶原蛋白升高最为显著（P＜0.001）。

表4 siRNA干扰敲除MMPs后，巩膜成纤维细胞MMP-1/2和Ⅰ型胶原蛋白水平

3 讨论

眼轴延长是近视发展的最基本病理过程。巩膜作为近视调控机制的最终靶组织，眼轴的延长总是伴随巩膜组织的进行性改变。高度近视患者可以发现巩膜显著变薄，尤其在眼球后极部。这种形态学的变化，与巩膜的生物力学特性密切相关，变薄的巩膜中胶原和葡聚多糖含量减少，巩膜延展性增加［4，7］。巩膜组织的重塑过程包括原有组织的降解和新组织的合成，降解与合成之间平衡的改变和近视发展密切相关［8-9］。在鸟类、哺乳动物以及人类的实验研究中发现，MMPs家族调节近视眼巩膜组织的降解过程［10-15］。尽管其他MMPs家族成员也可能参与巩膜组织的重塑过程，但是MMP-1或MMP-2目前被认为是最强的调控因子［16］。目前有大量文献研究［10，12，16-19］证实，无论是形觉剥夺还是光学离焦诱导的近视动物模型，巩膜MMP-2表达增加，细胞外基质降解增加，巩膜重塑，近视发生；而在近视恢复期时，MMP-2表达下降。因此，从细胞水平探讨MMP-1/2激动剂或抑制剂对巩膜成纤维细胞的作用以及对Ⅰ型胶原表达的影响，将能进一步揭示巩膜重塑的机制。

本研究通过体外细胞模型，检测MMP-1及MMP-2激动剂、抑制剂对MMP-1或MMP-2以及Ⅰ型胶原mRNA与蛋白水平表达的影响。结果表明MMPs激动剂引起MMP-1/2活性显著增加，Ⅰ型胶原mRNA和蛋白表达下降，MMPs抑制剂引起MMP-1/2活性显著下降，相应的Ⅰ型胶原mRNA和蛋白表达增加。尽管数据提示MMP-1抑制剂并未引起MMP-1 mRNA表达的明显下降，但MMP-1活性明显下降，MMP-1蛋白表达减少，巩膜成纤维细胞Ⅰ型胶原mRNA和蛋白原表达均增高；类似的，激动剂APMA并未引起MMP-2 mRNA表达的增加，但是MMP-2活性增强，其蛋白表达增加，导致Ⅰ型胶原mRNA和蛋白原表达均下降。由此可见，MMP-1/2激动剂或抑制剂可引起MMP-1/2活性的改变，伴随相应蛋白表达的改变，最终影响巩膜成纤维细胞Ⅰ型胶原的表达。其中，MMP-1/2mRNA表达的变化并不是最关键的因素，而其具有活性成分蛋白表达的改变才是最终引起Ⅰ型胶原表达改变的关键因素。

在应用siRNA干扰方法敲除MMP-1、MMP-2或同时两者均敲除后，MMP-1蛋白表达均显著降低，MMP-2除在MMP-1siRNA干扰敲除组无明显变化外，其余各组均显著下降。用siRNA敲除MMP-1/MMP-2，类似于MMP-1/MMP-2被抑制，Ⅰ型胶原的表达在各敲除组中显著增加。当MMP-1和MMP-2均干扰敲除时，Ⅰ型胶原的表达增加最为显著。由此可见，MMP-1和MMP-2在巩膜Ⅰ型胶原表达变化中起关键作用，且两者之间具有协同作用。

综上所述，本研究表明，在人巩膜成纤维细胞系中，MMP-1和MMP-2是调控巩膜Ⅰ型胶原重塑的关键因子，而巩膜重塑是近视眼眼轴延长的重要机制之一，本研究为今后通过药物干预巩膜胶原重塑过程来防治近视提供了实验依据。

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Effect of agonists and inhibitors ofmatrix metalloproteinases on expression ofmatrix metalloproteinase 1/2 and collagen I in human scleral fibroblast

ZOU Lei-lei，LIU Rui，LIU Hong，HUANG Li-wen，ZHOU Xing-tao，ZHOU Hao.Departmentof Ophthalmology，Eye Ear Nose and Throat Hospitalof Fudan University，Shanghai 200031，China Corresponding author：LIU Hong，Email：liuhongzef＠263.net

ObjectiveTo investigate the effect of agonist and inhibitor ofmatrixmetalloproteinase-1（MMP-1）and MMP-2 in matrix metalloproteinases（MMPs）on the expression of typeⅠcollagen and the effect of MMP-1 and MMP-2 in the development of human scleral collagen.Methods Human scleral fibroblast line was established as a model.Fluorescent quantitative assay was used to investigate the effect of P-aminophenylmercuric acetate（APMA）and inhibitors of MMP-1 and MMP-2 on MMP-1 and MMP-2 in human scleral fibroblast.Real-time PCR（RT-PCR）and Western-blotwere used to compare the expression ofmRNA and protein levels ofMMP-1、MMP-2 and typeⅠcollagen after exposure to APMA and inhibitors of MMP-1/2.Finally，Gene of MMP-1 or MMP-2 or both were knocked out with small interfering RNA（siRNA）and the expression of typeⅠcollagen was detected.Results APMA significantly improved the activity of MMP-1/2 and decreased the expression of typeⅠcollagen on both mRNA and protein levels（P＜0.01）；inhibitors of MMPs decreased the activity of MMP-1/2 and increased the expression typeⅠcollagen on both mRNA and protein levels（P＜0.01）.APMA increased the expression ofmRNA in MMP-1（P＜0.01）but not MMP-2（P＞0.05）.When gene of MMP-1 or MMP-2 or both were knocked out with siRNA，the protein levels of MMP-1 were significantly decreased（P＜0.01）；MMP-2 were also significantly decreased（P＜0.01）except in the MMP-1 knockdown group（P＞0.05）；TypeⅠcollagen were significantly increased（P＜0.01）especially when the MMP-1 and MMP-2 were both knocked out.Conclusions In human scleral fibroblast line，both agonistand inhibitor could change the activity and the protein level of MMP-1 and MMP-2 and finally change the expression of typeⅠcollagen.MMP-1 and MMP-2 were key factors in rebuilding of typeⅠcollagen in human sclera.（Chin JOphthalmol and Otorhinolaryngol，2013，13：91-95）

Human scleral fibroblast；Matrixmetalloproteinase 1；Matrixmetalloproteinase 2；Collagen，typeⅠ

2012-12-03）

（本文编辑 诸静英）

国家自然科学青年基金项目（81100689）；上海市科技人才计划项目（09PJ1402400）

复旦大学附属眼耳鼻喉科医院眼科 上海 200031

刘红（Email：liuhongzef＠263.net）

邹蕾蕾、刘睿同为第一作者