两种硬性接触镜护理液除蛋白作用及生物相容性的比较研究△

翁郁华 李伶俐 罗丽 南开辉 金婉卿 陈云云

两种硬性接触镜护理液除蛋白作用及生物相容性的比较研究△

翁郁华 李伶俐 罗丽＊南开辉 金婉卿 陈云云

目的将一种硬性接触镜护理液（RCLS）与现有同类产品MeniconProgent进行除蛋白作用、对人眼角膜上皮细胞毒性及动物刺激性的比较，综合评价其生物相容性。方法细胞毒性实验采用人眼角膜上皮细胞，分别用培养液、RCLS、MeniconProgent作用细胞不同时间，以WST-1试剂检测细胞存活率；取硬镜RGP镜片在2 mg/mL溶菌酶溶液中浸泡、吸附24 h，分别用RCLS和MeniconProgent浸泡吸附后的镜片，再用BCA法测定溶液中的蛋白含量；刺激性实验以新西兰白兔为实验对象，分别取0.1mL RCLS或MeniconProgent滴入兔眼，记录眼损伤；取沾有RCLS和MeniconProgent的纱布块敷贴于兔背部裸露皮肤处，敷贴后评价皮肤损伤程度。结果RCLS对硬镜表面吸附的溶菌酶有83.159％的除去率，相对于MeniconProgent的85.180％，差异无统计学意义；MeniconProgent接触15 min后即对人角膜上皮细胞有溶解作用，细胞毒性大，对兔眼有刺激，对皮肤也有轻度刺激，而RCLS作用人角膜上皮细胞1 h，细胞存活率＞80％，对兔眼及皮肤均无刺激。结论RCLS在细胞毒性及刺激性方面的生物相容性优于MeniconProgent。（中国眼耳鼻喉科杂志，2013，13：100-104）

硬性接触镜；护理液；除蛋白作用；生物相容性

接触镜又称隐形眼镜，有软镜和硬镜之分。硬性接触镜用于矫正屈光不正可以追溯到20世纪50年代。与软镜相比，硬镜的优点在于光学性能好、以矫正角膜散光、控制近视屈光度的增长［1］，用于矫正原发性角膜散光和各种继发性角膜散光（外伤所致的角膜散光、圆锥角膜、准分子激光屈光性切削术后散光等）［2］。

目前国内临床上应用的硬镜护理液种类很少，而且价格昂贵。由本院研制的一种硬性接触镜护理液（rigid contact lens care solution，RCLS），主要成分为三氟乙酸、聚氨丙基双胍，主要功能为除蛋白及清洁等。本文从除蛋白作用、细胞毒性以及动物刺激性方面，将其与同类产品美尼康清洁、除蛋白型硬镜护理液产品MeniconProgent作对比，评价RCLS的部分生物相容性，供临床应用参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 药物与材料 RCLS为无色透明液体，pH值为6.8～8.5，本院研制；MeniconProgent由日本美尼康株式会社提供；氟硅丙烯酸酯角膜接触镜由温州欣视界科技有限公司提供。

1.1.2 试剂 溶菌酶（＞20KU，sigma）；2，4-二硝基氯苯（AR，西亚试剂）；生理盐水注射液（浙江康乐药业股份有限公司）；WST-1细胞毒性测试试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物技术研究所）；DMEM/F12、磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS）、0.05％Trypsin-EDTA（gibco）。

1.1.3 实验动物 新西兰大白兔12只，体质量2.5～3.0 kg，雌雄各半，由丹阳市光明实验动物养殖场提供，合格证号：3200002369。

1.2 实验方法

1.2.1 人眼角膜上皮细胞培养 所用细胞系为ATCC CRL-11135 HCE-2，37℃、5％CO2条件下培养，培养基为含10％FBS、5μg/mL胰岛素，10 ng/mL EGF，100μg/mL青-链霉素的DMEM/F12（1∶1）培养液，待细胞生长至80％～90％融合时以1∶3～1∶10比例传代培养［3］。

1.2.2 体外细胞毒性实验方法［4］HCE-2细胞融合后用0.05％Trypsin-EDTA消化5 min，相对离心力为400×g离心3 min。用含2％FBS的DMEM/F12（1∶1）培养液配制终浓度为5×104个/mL的细胞液，接种于96孔板，每孔100μL。

WST-1法检测细胞活性：实验分3组，正常对照组、RCLS组、MeniconProgent组（含A液和B液，使用时A液与B液等量混合）；每组设5平行，共6个时间点：15 min、1 h、2 h、4 h、8 h、24 h。细胞培养18 h贴壁后，弃去原培养液，分别换成100μL的RCLS和MeniconProgent，对照组为等量新鲜培养液，分别在培养一定时间后用WST-1试剂检测各实验孔在450 nm吸光度（optical density，OD）值。计算细胞存活率=样品吸光度值/对照组吸光度值。

1.2.3 除蛋白功效实验方法 氟硅丙烯酸酯角膜接触镜27片，去离子水洗净烘干备用。配制2mg/mL溶菌酶溶液（溶液1），加入24孔板中，每孔2 mL，每孔放入3片镜片。模拟镜片在人眼内位置凸面向上放置，根据人眼眼表温度，将培养板置于34℃恒温孵育24 h［5］。

BCA法测定蛋白浓度。实验分3组：对照组、RCLS组、MeniconProgent组，每组3平行。各孔镜片在34℃孵育24 h后（溶液2），放入另一孔含等量PBS中漂洗一遍（溶液3）；再分别置于含有2 mL RCLS或MeniconProgent的新孔中，室温下浸泡30 min（溶液4），对照组以PBS代替；作用30 min后，每组镜片再依次用PBS漂洗2遍（溶液5）。BCA法分别测定溶液1、2、3、4、5中溶菌酶的含量［6］。计算镜片吸附蛋白量：A=B-C-D（A：镜片吸附溶菌酶的量；B：溶液1溶菌酶的量；C：溶液2溶菌酶的量；D：溶液3溶菌酶的量）；计算两组护理液洗脱蛋白量：E=F+G（E：洗脱蛋白量；F：溶液4溶菌酶的量；G：溶液5溶菌酶的量）；计算两组护理液的除蛋白率：H=E/A×100％。

1.2.4 兔眼刺激实验［7-8］实验前1 d用1％荧光素钠染色、裂隙灯检查兔眼，选择无任何眼病变及炎症的健康新西兰白兔6只。每只兔左眼下结膜囊内分别滴入0.1 mL RCLS或MeniconProgent，被动闭眼2 s。同法右眼作为对照眼，滴入等量生理盐水。分别在滴眼后1 h、24 h、48 h和72 h裂隙灯检查角膜、虹膜、结膜情况，拍照记录，根据国家标准GB/T 16886.10-2005眼损伤记分系统记分［9］。

1.2.5 兔皮肤刺激实验［10-13］新西兰大白兔6只，实验前一天将背脊两侧的毛用剃须刀剃去，约10 cm× 15 cm大小区域。取2.5 cm×2.5 cm大小的两层纱布块若干，每块纱布块滴加0.5 mL样品溶液浸湿，阳性对照物为质量分数1％2，4-二硝基氯苯（CDNB）的丙酮-橄榄油溶液（丙酮∶橄榄油=1∶1），阴性对照为等量的生理盐水溶液；将纱布块贴敷于兔子裸露皮肤处，纱布块上覆盖一层保鲜膜、两层干纱布，最后以医用透明敷料固定，敷用时间6 h。连续敷5 d，在除去受试物后1 h、24 h、48 h、72 h观察皮肤反应。按照GB/T 16886.10-2005皮肤反应记分系统记分，根据刺激反应类型评价刺激强度。

1.3 统计学处理 运用SPSS19.0统计软件进行统计，实验数据均以均数±标准差表示；采用配对样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞毒性实验 短期作用HCE-2细胞（15 min～1 h），RCLS组细胞均存活86.067％，细胞形态与对照组无异，呈梭形和三角形（图1）；作用2 h，细胞存活51.125％，因营养耗竭，细胞由伸展状态逐渐回缩变圆；作用时间延长至24 h时，细胞存活率逐渐降低，大部分都收缩变圆，但仍有11.685％存活。而MeniconProgent在作用初始15min即对细胞有腐蚀作用，使细胞解离成碎片，对细胞毒性极大。两组护理液作用不同时间细胞存活率，差异有统计学意义（P＜0.05，表1）。

表1 不同实验组作用HCE-2细胞450 nm吸光度值（OD）及细胞存活率（±s，n=5）

表1 不同实验组作用HCE-2细胞450 nm吸光度值（OD）及细胞存活率（±s，n=5）

作用时间吸光度值细胞存活率（％）MeniconProgent RCLS MeniconProgent RCLS 15 min 0.188±0.003 0.253±0.004 0.000 86.067 1 h 0.176±0.005 0.245±0.004 0.000 83.211 2 h 0.181±0.001 0.234±0.006 0.000 51.125 4 h 0.190±0.001 0.216±0.001 0.000 18.548 8 h 0.203±0.003 0.224±0.011 0.000 16.078 24 h 0.159±0.001 0.180±0.003 0.400 11.685

图1.护理液作用不同时间HCE-2细胞的形态变化

2.2 除蛋白功效比较 RCLS与MeniconProgent同时浸泡镜片30 min，对镜片吸附蛋白的除去率，前者为83.159％，后者为85.180％，两组护理液除蛋白功效差异无统计学意义（P=0.81，P＞0.05）。

2.3 兔眼刺激实验 给药前及停药后1 h、24 h、48 h、72 h用裂隙灯检查兔眼，观察眼结膜、角膜、虹膜和其他部位的损伤情况，将每一观察时间点及每一动物的眼结膜、虹膜和结膜的刺激反应分值相加得总积分，将每组的总积分除以动物总数，既得刺激积分。停药后，与生理盐水对照组相比，RCLS组兔眼在任何阶段均未出现眼睑水肿、分泌物增加等刺激性反应，眼部刺激积分均为0（表2）；MeniconProgent组滴眼后1 h，兔眼结膜弥散性充血且明显水肿，眼内分泌物明显增多，浸湿眼睑及睫毛（图2）；荧光素钠染色后角膜有斑点状染色区域。给药后24 h均恢复正常。

2.4 兔皮肤刺激实验 连续5次敷贴给药后，CDNB阳性对照组皮肤在各观察期内均有红斑、水肿且结痂的现象，敷贴期间兔子伴有疼痛、抓挠表现。RCLS组和生理盐水对照组在敷贴期间兔子均无异常表现，其中，RCLS组皮肤出现极轻微红斑，随着观察时间的延长，红斑逐渐消失；MeniconProgent组皮肤有明显红斑、轻微水肿。根据刺激评分，RCLS组各时间点刺激积分均小于0.5（表3），与阴性对照生理盐水组一样属于无刺激物，MeniconProgent对皮肤有轻度刺激，CDNB阳性对照则对皮肤有重度刺激。

表2 兔眼刺激实验评分表（±s，n=3）

表2 兔眼刺激实验评分表（±s，n=3）

组别给药前1 h 72 h生理盐水对照组停药后1 h停药后24 h停药后48 h停药后0 0 0 0 0 RCLS组0 0 0 0 0 MeniconProgent组0 3.670±0.577 0 0 0

图2.眼刺激1h后兔眼表现

表3 兔皮肤多次刺激评分表±s，n=6）

表3 兔皮肤多次刺激评分表±s，n=6）

组别停药后1 h停药后24 h停药后48 h停药后72 h生理盐水对照组0000 RCLS组0.417±0.500 0.167±0.577 0.167±0.577 0.083±0.500 MeniconProgent组1.667±0.000 1.334±0.577 0.667±0.000 0.166±0.577 CDNB阳性对照组7.067±0.548 6.267±0.894 5.467±0.447 5.433±0.548

3 讨论

RCLS的主要除蛋白成分为三氟乙酸，是一种强酸。早在1990年有人用其与乙腈的混合溶液萃取软镜镜片上吸附的蛋白，章瑾等［6］也对其最佳的除蛋白浓度做了研究。MeniconProgent为一种强效清洁、除蛋白护理液，主要成分A液为NaCLO，B液为KBr，两者混合后pH值约为10.5。其除蛋白原理为A、B液反应后生成的NaOH、次氯酸和溴单质，NaOH发挥除蛋白作用，次氯酸发挥漂洗作用。本文将功能类似的2种护理液RCLS和MeniconProgent的除蛋白效果作比较，结果发现，RCLS的除蛋白效率为83.159％，MeniconProgent为85.182％，两者差异无统计学意义。

影响护理液生物相容性的因素有很多，pH值、渗透压的变化、不同的化学成分均能带来不同的影响。本院在研制RCLS时充分考虑了溶液的酸碱度，其pH值也完全在眼睛耐受范围之内。为了研究护理液的化学成分在人眼内的相容性，分析护理液的滞留对人角膜细胞的影响，本文也研究了RCLS与MeniconProgent对人眼角膜上皮细胞的毒性。结果发现，MeniconProgent对细胞作用15 min即能将细胞全部溶解，细胞毒性极大，不能直接接触人眼。RCLS作用细胞短期内（＜1 h）细胞存活率均大于80％，细胞形态正常；作用2 h，细胞约有一半形态皱缩变圆，细胞间隙变大；持续作用时间延长至24 h时，因营养的耗竭，细胞的毒性也继续加大。由此说明，相对于MeniconProgent而言，RCLS的细胞相容性更优，如不慎入眼，短期内（＜1 h）对角膜细胞没有大的损伤，但是也不能作为滴眼剂经常入眼。通常情况下，硬镜在经过除蛋白护理液护理后要用更加温和无刺激的全功能护理液冲洗才能佩戴。

药物对眼刺激实验表明：RCLS对兔眼角膜、虹膜、结膜等均无刺激性，各组平均记分为0。相比RCLS，MeniconProgent滴眼后1 h兔眼结膜弥散性充血且明显水肿，眼内分泌物明显增多，浸湿眼睑及睫毛，荧光素钠染色后角膜有点状弥漫性染色区域，说明MeniconProgent对兔眼有刺激性。兔的多次皮肤给药刺激实验结果发现：RCLS对兔皮肤刺激积分＜0.5，与生理盐水一样属于无刺激物；而同类产品MeniconProgent给药后1 h，兔皮肤出现明显红斑，对皮肤有轻度刺激。

综上所述：在除蛋白型硬镜护理液产品中，护理液RCLS与现有市售产品MeniconProgent通过BCA法测得的除蛋白效果无异，其对角膜上皮细胞毒性，眼内、皮肤刺激性更小。但是，也应指出的是，本研究中的测定浸泡过吸附有溶菌酶镜片的护理液蛋白含量，为间接反映护理液的除蛋白效果，尚需结合直接测定方法比较除蛋白效果，这也是我们下一步的工作。RCLS目前仍处于临床前研究阶段，为了全面评价其功能，也需要多种指标进行评价，本文的研究也为后续的清洁、消毒、镜片相容性等研究奠定了基础。

（本文作者与研究产品的生产和销售厂商无任何经济利益关系）

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Deproteinization efficacy and biocompatibility between a new rigid contact lens care solution and MeniconProgent

WENGYu-hua，LI Ling-li，LUO Li＊，NAN Kai-hui，JINWan-qing，CHEN Yun-yun.Institute of Biomedical Engineering，Eye Hospital ofWenzhou Medical College，Wenzhou 325027，China

NAN Kai-hui，Email：nankh＠163.com

ObjectiveTo evaluate the biocompatibility of a new type of rigid contact lens care solution（RCLS）including deproteinization effect，cytotoxicity on human corneal epithelium cells，irritation of eyes and skin，compared with MeniconProgent，a commercially available contact lens care solution.Methods The human corneal epithelial cells HCE-2 were planted in 96-well plates，co-cultured with RCLS，MeniconProgent and cell medium respectively.Cell viability was determined usingWST-1 reagent to detect the absorbance ofeach well after exposure for different time at450 nm；For deproteinization efficacy experiment，two groups of rigid contact lenswere soaked in 2mg/mL lysozyme solution for 24 hours，then immersed in RCLSor MeniconProgent for30min.The protein contentof each solution was determined with BCA kit；The New Zealand white rabbits were chosen to take irritant experiment.Each rabbit had one drop testing solution in one eye.The resultwas recorded after experiment.The gauze pieceswas steeped with RCLSorMeniconProgent before fixing them onto the skin of rabbits′back，and the injury of the skin was evaluated.Results The RCLS had a 83.159％deproteinization rate of lysozyme adsorbed upon the surface of lens，comparing to MeniconProgent of85.180％，which had no significant difference.Cytotoxicity results showed thatMeniconProgentmight lead to cell lysiswhich reveals a severe toxicity on corneal epithelium cells，and italso has irritating effect to eyes and skin.When co-cultured in RCLS for an hour，the toxicity of RCLSwas less than 20％，neither irritating to the rabbiteyes nor to the skin.Conclusions RCLShad a superior biocompatibility comparing to MeniconProgent in regard to cytotoxicity and irratanting.（Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol，2013，13：100-104）

Rigid contact lens；Caresolution；Deproteinization efficacy；Biocompatibility

2012-09-20）

（本文编辑 诸静英）

国家国际科技合作专项项目（2012DFB30020）；浙江省重点科技创新团队项目（2009R50039，2011R09039-13）；

浙江省卫生高层次创新人才培养工程项目（2010）；温州市科技计划项目（Y20100339）

温州医学院眼视光学院医院生物医学工程研究院 温州 325027；＊爱尔康（中国）眼科产品有限公司 北京 100016

南开辉（Email：nankh＠163.com）