饲料调味剂中六种香料成分含量的气相色谱测定方法

2013-02-19游飞明欧阳立群黄红霞

饲料工业 2013年24期

■游飞明林钦欧阳立群黄红霞

(福建省产品质量检验研究院，国家加工食品质量监督检验中心，福建福州 350002)

随着饲料工业的发展，各种饲料资源的开发和动物营养学研究的进步，饲料的生产越来越注重其营养性及适口性。为了改善饲料的气味和口味，通过动物的嗅觉和味觉引诱和增进动物采食，因此在饲料中添加各种调味剂已越来越普遍。饲用调味剂的种类很多，常用的调味剂主要有香料及其他引诱剂、甜味剂和谷氨酸钠，香料是目前应用最为广泛的饲用调味剂之一。但调味剂的添加是在保持饲料质量前提下对饲料的衬托，而不能过分依赖它，目前一些养殖户在调味剂应用上有一个误区，认为香味越浓越好，实际上这可能对饲料的诱食性产生负面影响，因为大剂量使用这些香料也可能会有害动物的健康。早在2000年欧盟专家委员会称，经多年的实验研究发现，大剂量使用香兰素可以导致动物头晕、恶心、呕吐、呼吸困难，甚至能够损伤肝、肾，对动物有较大危害。目前，国内外对乳酸乙酯、乙基麦芽酚及乙基香兰素等的研究多集中在酒中芳香性成分分析、香料植物芳香性成分分析以及食品中香料成分的分析等。对于同时测定饲料中乙基香兰素、乙基麦芽酚的方法有少量文献报道，但饲料中6种香料成分的同时测定方法，目前还鲜有文献报道，因此建立一种灵敏有效、简便快速且同时测定多种香味剂的检测方法在实际工作中具有很强的实用性。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

气相色谱仪（Agilent公司），分析天平（德国Sartorius公司），旋涡混均器（江苏康健医疗用品有限公司）。所用试剂除特别标注外均为分析纯试剂，6种香料成分标准品（乳酸乙酯、乳酸丁酯、麦芽酚、乙基麦芽酚、甲基环戊烯醇酮、乙基香兰素）纯度均≥98.0%；甲醇、乙醇、丙酮及氯仿、甲酸；提取剂酸化丙酮：500 ml丙酮加入0.2 ml甲酸，混匀。

1.2 气相色谱条件

检测器：氢火焰离子化检测器，温度280℃；色谱柱：VB-WAX（30 m×0.32 mm×0.25 μm）；柱温：程序升温，初始温度65℃，恒温4 min，以30℃/min速率升温到 240℃，恒温3 min；进样口温度：250 ℃；进样量：1 μl；柱流量：2.0 ml/min；分流比：30∶1。

1.3 样品前处理

称取试样0.5 g(准确至0.000 1 g)，置于25 ml容量瓶中，加入20 ml提取剂酸化丙酮溶液，在旋涡混匀器上涡旋2 min，用酸化丙酮溶液定容至25 ml，充分摇匀，静置6 h，取上清液供气相色谱进样分析。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的确定

2.1.1 色谱柱及柱温的选择

这几种物质的极性比较强，因此本实验选择极性比较强的VB-WAX色谱柱作为分离色谱柱。由于6种目标分离物沸点差异较大，在恒温条件下目标物分离时间长，且高沸点组分峰型拓宽，所以采用程序升温的条件。实验通过对初始温度、升温速率等参数反复优化比较，最后确定柱温升温程序为：65℃保持4 min，后以30℃/min上升到 240℃，保持3 min，共用13 min。

2.1.2 进样口温度、分流比优化

试验比较了230、250℃时的气化室温度对6种香味剂色谱峰行为进行了考察。实验结果表明，不同进样口温度下，6种香味剂的峰形及响应值差异不显著。实验在确保目标组分充分汽化的前提下，结合文献报道，最终选择进样口温度为250℃。本实验结合方法检测限和仪器灵敏度选择分流比30∶1。

2.1.3 检测器温度的选择

检测器温度一般比目标物沸点高30～50℃，多组分分析一般检测器温度不得低于程序升温最高温度，在不影响分析结果的情况下，检测器温度适当高点可减少检测器被污染，综合考虑这些因素，选择检测器温度为280℃。

2.2 样品前处理过程的优化

2.2.1 提取溶剂选择

本文选择了4种有机溶剂（甲醇、无水乙醇、丙酮及三氯甲烷）作为提取剂，比较了这4种不同提取溶剂对饲料调味剂样品中6种香料成分的提取效果。具体实验步骤为：称取0.5 g左右阳性试样（平行样各3份），分别以25 ml不同提取溶剂涡旋2 min提取，放置6 h后进样分析。结果见表1，结果表明，在这4种提取剂中，丙酮提取效果最佳。

2.2.2 甲酸浓度的选择

研究表明，乙基香兰素在酸性条件下，以分子形式存在，可用有机溶剂有效提取。此外，麦芽酚、乙基麦芽酚、甲基环戊烯醇酮等在酸性条件下比较稳定，因此，在实验过程中，加入甲酸对提取效果进行了研究。实验比较了丙酮加入甲酸浓度分别为0、0.02%、0.04%、0.08%及1.0%作为提取剂，提取样品中6种香料成分，放置6 h后进样检测，对提取效果进行比较。表2实验结果表明，加入甲酸会明显提高实际样品中麦芽酚等香料成分的提取量，而加入甲酸的量大于0.04%后对提取的效果无明显影响，所以选择甲酸的浓度为0.04%，因此，选择的提取剂为酸化丙酮（含0.04%甲酸）。

表1 不同提取剂提取效果比较(%)

表2 甲酸浓度对提取效果影响(%)

2.2.3 提取时间的选择

合理的提取时间对样品的提取效果有很大的影响。在样品中加入提取剂20 ml酸化丙酮溶液后涡旋2 min，之后放置2、4、6、8、24 h，在放置过程中不时振摇，待静置到上层溶液澄清后进样分析，结果如图1所示。结果表明，放置6 h后，6种香料成分的提取结果趋于稳定，因此放置时间设定为6 h。

图1 提取时间的选择

2.3 线性范围及检出限

配制6种调味剂系列标准溶液0.01～5.0 mg/ml，按照本实验的操作条件下进行分析，以峰面积Y对标样浓度X进行线性回归，平行测定2次，结果如表3所示。结果表明，6种香料成分在此范围内线性良好。根据3倍的信噪比计算方法的检测限得到本方法检测限，乳酸乙酯为37.5 mg/kg，乳酸丁酯、麦芽酚、乙基香兰素均为20.0 mg/kg，乙基麦芽酚为17.5 mg/kg，甲基环戊烯醇酮为15.0 mg/kg。6种香料成分标准品的色谱图如图2所示，试样的色谱图如图3所示。

表3 线性范围及方法检测限

图2 6种目标分析物标准气相色谱图

图3 试样的气相色谱图

2.4 回收率和精密度

为了考察方法的准确性和重复性，在空白样品基质中分别加入2种不同浓度的混合标准溶液进行回收率实验，每个水平平行测定6次，结果如表4所示，结果表明该方法具有良好的精密度和准确度：添加量约为0.5%时，平均回收率在102.0%～103.0%之间，相对标准偏差（RSD）在0.7%～1.2%之间；添加量约为5.0%时，平均回收率在99.6%～100.2%之间，相对标准偏差（RSD）在1.1%～1.4%之间。