益生菌固态发酵对白酒丢糟营养成分含量变化的影响分析

■ 税朝毅 吴力克 张 娟 陈丙波

(1.第三军医大学微生态研发中心，重庆 400038；2.第三军医大学实验动物中心，重庆 400038)

白酒丢糟是白酒酿造工艺中的主要副产物。初步分析，白酒丢糟中除了含有蛋白质外，还含有丰富的纤维素、木质素、脂肪、磷、钙以及丰富的B族维生素和生长素等物质，营养价值比较丰富[1-2]。为了提高白酒丢糟的利用价值，可运用现代生物技术对其进行处理，将内含的纤维素、木质素降解[3-4]，并通过增加其中的益生菌及其代谢产物，改变白酒丢糟的营养成分及其含量，转化为动物生长可利用的物质。

本试验是以白酒丢糟为基料，先运用木质素酶和纤维素酶两种粗酶液进行酶解[5-6]，进而以益生菌单菌（分别为纳豆芽孢杆菌、啤酒酵母菌、米根霉菌）、益生菌两菌组合以及三菌组合，对酶解处理后的白酒丢糟产物进行固态发酵[7]。通过分析比较白酒丢糟原料、其酶解产物和固态发酵产物中的营养成分及其含量变化（包括粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、氨基酸等项目），为利用白酒酿制的副产物——白酒丢糟开发生产优良的生物饲料和/或微生态制剂类饲料添加剂产品提供相关参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器

1.1.1 主要原料

白酒丢糟：重庆江津酒厂提供，使用前经晒干、粉碎，20目过筛；麸皮：石家庄市禾惠食品公司提供；豆粕：石家庄牧乐商贸有限公司提供；尿素：成都市科龙化工试剂厂提供。

1.1.2 主要试剂

牛肉膏、蛋白胨：北京奥博星生物技术有限公司；葡萄糖、氯化钠、氢氧化钠：成都市科龙化工试剂厂；磷酸二氢钾：重庆北碚化学试剂厂；硫酸镁：重庆博艺化学试剂有限公司。

1.1.3 主要仪器

电热恒温培养箱：上海齐欣科学仪器有限公司；高压蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；超净工作台：苏州净化设备有限公司；恒温摇床：上海齐欣科学仪器有限公司；电子天平：上海光正医疗仪器有限公司；实验型固态发酵装置：第三军医大学微生态研发中心自制。

1.1.4 试验菌种

啤酒酵母菌、米根霉菌、纳豆芽孢杆菌、云芝菌、绿色木霉菌由第三军医大学微生态研发中心菌种库保存。

1.1.5 试验用菌种培养基

普通培养基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化钠5 g、蒸馏水 1 000 ml，pH 值7.0～7.2，121 ℃灭菌20 min，冷却备用。

沙氏培养基：葡萄糖20 g、蛋白胨10 g、蒸馏水 1 000 ml，pH值6.8～7.0，115 ℃灭菌20 min，冷却备用。

综合PDA培养基：20%马铃薯汁1 000 ml、葡萄糖20 g、磷酸二氢钾3 g、硫酸镁1.5 g，pH值5.8～6.0，115℃灭菌20 min,冷却备用。

1.2 试验方法

1.2.1 酶解液制备及白酒丢糟酶解过程

1.2.1.1 云芝和绿色木霉的复苏

配制综合PDA培养基，121℃灭菌20 min，冷却至30℃备用。分别取云芝和绿色木霉斜面菌种各一支在超净工作台上接种于冷却后的综合PDA培养基中，150 r/min、28℃恒温摇床培养，其中云芝培养5 d，绿色木霉培养3 d。

1.2.1.2 木质素酶和纤维素酶的制备

将复苏后的液体菌种分别接种于灭菌冷却后的综合PDA培养基中，接种量为2%,150 r/min、28℃恒温摇床培养，木质素酶生产菌培养12 d[8]，纤维素酶生产菌培养5 d[9]，发酵终止后，离心发酵液，所得上清液即为木质素酶和纤维素酶粗酶液。

1.2.1.3 木质素酶和纤维素酶对白酒丢糟的酶解过程

将白酒丢糟粗粉（20目）121℃灭菌30 min后冷却至室温，加入酶解液,比例为白酒丢糟∶酶解液=1∶2(其中木质素酶∶纤维素酶=1∶1)，混匀后密封，放入30℃的环境中静置3 d后,酶解结束。将酶解后产物经40℃真空干燥后备用。

1.2.2 发酵培养基基质制备和发酵过程

1.2.2.1 发酵培养基基质制备

以上述酶解产物为主要基料，辅以麸皮、豆粕、尿素等，按酶解产物100份+麸皮2份+豆粕2份+尿素1份，加适量无菌水,pH值为6.0～6.5，作为发酵培养基,放入高压灭菌锅，在121℃下杀菌30 min,冷却备用。

1.2.2.2 固态发酵用菌种的制备方法

啤酒酵母菌：啤酒酵母菌株在沙氏培养基30℃液体培养48 h后，用接种环取3～5环到锥形瓶，180 r/min培养48 h；米根霉菌：米根霉菌株在综合PDA培养基30℃液体培养24 h后，取2%的量接种到锥形瓶，180 r/min培养24 h；纳豆芽孢杆菌：纳豆芽孢杆菌菌株在普通培养基37℃液体培养24 h后，取2%的量接种到广口瓶静置培养24 h。

1.2.2.3 固态发酵过程

将上述益生菌种子菌液按10%的接种量，接入自制的实验型固态发酵器(发酵基质100份+麸皮2份+豆粕2份+尿素1份)中，无菌条件下拌匀，使含水量在65%～70%，于（30±1）℃培养96 h，期间翻曲。于发酵终点收集发酵产物，40℃通风干燥后包装收藏（酶解及固态发酵过程见图1）。

图1 酶解及固态发酵过程

1.2.3 营养成分分析方法

粗蛋白、粗脂肪、粗纤维测定分析分别采用GB/T 6432—94、GB/T 6433—2006、GB/T 6434—2006等规定的方法。氨基酸定量分析采用日立L—8800型全自动氨基酸分析仪测定。

2 结果与讨论

2.1 酶解处理对粗纤维含量的影响

白酒丢糟虽然是经提取后的弃渣，但是其中仍含有大量的营养成分，很多成分被包裹在渣体原料的细胞壁内。细胞壁是由纤维素、半纤维素、果胶质、木质素等物质构成的致密结构，对其进行破除有利于营养成分的析出以及被益生菌充分利用。本试验在上述确定的酶解条件及过程下，对白酒丢糟进行酶解。经测定，白酒丢糟酶解前后的粗纤维含量结果如表1所示。

表1 白酒丢糟酶解前后的粗纤维含量（g/100 g）

表1结果表明,酶解后的白酒丢糟酶解产物中，粗纤维含量降低了11.2 g/100 g，降低幅度达50.9%。上述结果提示，选用纤维素酶、木质素酶液对白酒丢糟进行酶解，可以使细胞壁及细胞间质中的纤维素、半纤维素、木质素等物质发生降解，破坏细胞壁的致密构造，减小细胞壁、细胞间质等传质屏障对营养成分从胞内向外的传质阻力，从而有利于营养成分的溶出。

2.2 益生菌不同组合方式固体发酵对发酵产物中营养成分含量的影响

本文将试验用益生菌菌种分为各个单菌、每两菌组合、三菌组合共7组，各组配比见表2。

表2 试验益生菌菌种分组

利用已制备的发酵培养基，按表2进行分组接种各组益生菌菌液，按照上述确定的发酵过程进行发酵，对发酵产物和原始白酒丢糟进行营养成分测定和比较，结果如表3～表4所示。

表3 原始白酒丢糟与各发酵产物中营养成分含量（g/100 g）

表3结果表明：与原始白酒丢糟相比，各发酵产物中粗蛋白、粗脂肪、氨基酸含量均增加，而粗纤维含量均下降，干物质总量变化则不明显。其中：粗蛋白含量分别增加了36.47%、38.45%、40.08%、58.33%、57.40%、59.77%、85.50%；粗脂肪含量分别增加了15.65%、12.24%、17.69%、46.94%、53.74%、48.30%、76.19%；粗纤维含量分别降低了51.00%、51.04%、51.09%、51.04%、50.95%、51.09%、51.14%；氨基酸含量分别增加了26.75%、27.60%、28.06%、57.53%、61.65%、60.34%、97.94%。

表4 原始白酒丢糟与各发酵产物中氨基酸含量（g/100 g）

分析上述各组试验结果，表明：①综合考虑各项指标，A组（啤酒酵母）发酵产物中各营养组分增加幅度与其它发酵组比较最低，提示单纯酵母发酵效果一般，但试验中发现酵母菌在以酒糟为基础培养基发酵过程中增殖和存活度较高（另文发表）。已知啤酒酵母菌富含蛋白质、核酸、多种维生素和酶等特殊营养成分，应用于饲料中保证饲料适口性好，可提高消化吸收率，改善肠道微生态环境[10]，故A组发酵产物可能具有特殊营养意义。②B组（米根霉）发酵产物中蛋白质和氨基酸的增加幅度优于A组发酵产物，提示其中的蛋白酶活跃程度高于后者。有文献报道，米根霉菌在发酵过程中还能分泌淀粉酶[11]、糖化酶[12]和脂肪酶[13]，可降解植物性饲料中某些复杂的碳水化合物，如将淀粉转化为葡萄糖利用，从而能够提高饲料转化率；还可产生乳酸[14]，而后者具有良好风味，可增加家畜饲料的适口性；米根霉菌体、菌丝均为白色，使发酵后发酵产物的色泽外观易于被饲喂动物接受。③对C组（纳豆芽孢杆菌）发酵产物中的营养成分含量变化进行分析，发现其粗蛋白、粗脂肪和氨基酸的增加幅度优于A组和B组，提示纳豆芽孢杆菌较啤酒酵母和米根霉具有更强的蛋白酶和脂肪酶活性[15]，对改善发酵对象（白酒丢糟）的营养品质作用更为明显，已有文献报道，在猪饲料中添加纳豆芽孢杆菌能明显提高仔猪生长性能和饲料转化率。④分析D组（啤酒酵母+米根霉）发酵产物、E组（啤酒酵母+纳豆芽孢杆菌）发酵产物和F组（米根霉+纳豆芽孢杆菌）发酵产物，发现任两种上述益生菌组合发酵白酒丢糟，其发酵产物中粗蛋白、粗脂肪和氨基酸的增加幅度均优于前述的单菌种发酵，提示益生菌混合发酵对改善发酵对象（白酒丢糟）营养品质的作用优于单菌发酵。⑤最后，将三种前述益生菌共混发酵，得G组（啤酒酵母+米根霉+纳豆芽孢杆菌）发酵产物，从表3结果可知，三菌共混发酵产物中粗蛋白、粗脂肪和氨基酸的增加幅度明显优于前述的单菌种发酵和两菌混合发酵，提示多菌混合发酵为有效改善发酵对象（白酒丢糟）营养品质的更佳方式。

分析表1、表3结果还发现，无论单菌发酵、双菌混合发酵还是三菌共混发酵，均未对粗纤维和干物质的含量变化产生明显影响，试验结果提示：①发酵产物中粗纤维的减少主要是前期酶解工艺中应用云芝和绿色木霉的结果，即啤酒酵母、米根霉和纳豆芽孢杆菌并无显著分解纤维素和木质素的能力，与文献报道相符[16-17]。②发酵产物中的干物质总量与原始白酒丢糟比较，并无显著变化，提示所用益生菌主要参与了对发酵对象（白酒丢糟）的生物转化过程，其本身的生物量并未对各发酵产物的构成产生显著影响。

2.3 各组发酵产物中基础营养物质——氨基酸含量比较

表4结果表明：经过啤酒酵母、米根霉和纳豆芽孢杆菌三种益生菌单菌、两两菌组合与三菌组合发酵后，各组白酒丢糟发酵产物中各类氨基酸均有增加，其中三菌组合发酵后各种氨基酸增加量优于两两菌组合发酵后各种氨基酸含量，而两两菌组合发酵后各种氨基酸增加量又优于单菌发酵。所测得A、B、C、D、E、F、G各组发酵产物中，必需氨基酸含量增加幅度分别为32.39%、33.58%、34.13%、81.24%、86.50%、81.11%、134.52%，数据提示，三菌共混发酵产物中的必需氨基酸含量显著高于前述各组，营养价值明显提高。

3 小结

本试验应用微生态工程技术，对白酒酿造产业中产出量最大、营养价值和利用价值最低的副产品——白酒丢糟(以稻壳和高粱壳为主，主要用作白酒发酵过程的通气垫料)进行生物转化改造，旨在通过大幅提高其基础营养和特殊营养价值，使其能够成为饲料原料和/或生物饲料。饲料的品质不仅影响饲粮的适口性、采食量和消化率，而且影响猪对饲料的利用率、日增重和胴体的品质。研究结果表明，应用微生物来源的木质素酶和纤维素酶酶解工艺，能够有效降解白酒丢糟中的纤维素和木质素，增加细胞及其胞壁内营养物质的溶出；应用适合于固体发酵的啤酒酵母、米根霉和纳豆芽孢杆菌三种益生菌进行单菌发酵、两菌混菌发酵和三菌共混固体发酵工艺，得到不同发酵产物，经与原始白酒丢糟比较分析，发酵产物中的主要营养成分——粗蛋白、粗脂肪及总氨基酸的含量明显提高，必需氨基酸含量亦明显增加，而营养抗性物质——粗纤维的含量则大幅下降，说明本技术工艺明显提升了白酒丢糟的营养价值，而其中又以多菌共混发酵效果最佳。此外，研究还发现各组发酵产物中存在大量活性益生菌及其产生的极其丰富的特殊营养和功效成分（另文发表），进一步提高了发酵产物的营养和功能价值。本文结果初步表明，白酒丢糟可通过先进的生物技术手段转换成优良的饲料原料、配料、添加剂或直接用作生物饲料，大幅提高该副产品的附加值；不仅为白酒酿造业的主要副产品之一——白酒丢糟找到了理想的出路，在避免环境污染问题的同时提高企业的经济效益，还能够为生态养殖业提供成本低廉、品质优良的饲料来源，具有广阔的市场前景和巨大的社会和生态效益。