维生素E和硒对吉富罗非鱼生殖激素及免疫功能的影响

2013-02-19希黄凯程远蒋焕超黄秀芸

饲料工业 2013年24期

■覃希黄凯程远蒋焕超刘康黄秀芸黄清

（1.广西大学动物科学技术学院，广西南宁 530004；2.广东粤海饲料集团有限公司，广东湛江 524001）

维生素E（VE）又称生育酚，是一种重要的维生素，具有调节鱼类体内性腺中类固醇激素生物合成的作用，与鱼类的生长繁殖、性腺发育、卵子和精子质量及胚胎发育等关系密切，可刺激脑垂体分泌促性腺激素释放激素，调节性激素的生成，能增强卵巢机能，促进卵泡黄体细胞分裂增殖，还可作为抗氧化剂预防精子被氧化，保护精子的活力[1]。VE作为一种高效抗氧化剂，通过抗氧化作用维持细胞膜的完整性，使免疫细胞能够正常发挥其免疫功能。此外，VE还可激活B淋巴细胞的增殖，参与IgG和IgM抗体的合成[2]，从而发挥免疫功能。硒（Se）是动物必需的微量元素，与VE在营养作用上有很多相似之处，二者存在协同作用但不能完全代替。Se作为一种重要的抗氧化剂，能清除精子上的自由基，从而保护精子形态结构和功能的完整，对动物的繁殖具有重要的影响。在免疫方面，Se能刺激免疫球蛋白的形成，提高机体合成IgG、IgM等抗体的能力，增强机体免疫功能[3]；另外，Se对清除循环系统免疫复合物、加强吞噬细胞的吞噬功能及活化适应性免疫细胞产生特异性免疫反应等也起着重要的作用[4]。大量研究发现，VE和Se在生物体生殖和免疫方面有重要作用[5-9]。

关于单独添加VE对水生动物生殖和免疫等的报道已有不少，VE和Se同时添加对水产动物免疫的影响，在刺参[10]和牙鲆[11]上有类似研究。目前，饲料中添加VE、Se及二者联合使用对吉富罗非鱼生殖激素和免疫的影响报道甚少。吉富罗非鱼具有生长速度快、个体大、出肉率高、遗传性状稳定等优点，是我国目前罗非鱼养殖中一个新的重要品系[12]，因此，本试验以吉富罗非鱼为研究对象，探讨了VE、Se以及二者的交互作用对吉富罗非鱼生殖激素和免疫功能的影响，为配制罗非鱼免疫增强添加剂配方，研发生殖期高效环保饲料提供依据，同时也对促进健康罗非鱼苗种的批量培育有着重要的参考意义。

1 材料与方法

1.1 试验用鱼及饲料制备

吉富罗非鱼由广西水产研究所提供，挑选平均初始体质量为（0.37±0.01）g、平均初始体长为（2.4±0.04）cm，健康、活力较强、规格均匀的吉富罗非鱼幼鱼作为试验对象。饲料以鱼粉和豆粕为蛋白源，大豆油为脂肪源。在基础饲料中分别添加0、0.15 mg/kg的Se，每一Se水平下分别添加0、30、60、90、120 mg/kg的VE，共制成10种试验饲料。饲料制成直径为2 mm的颗粒，40℃烘箱中烘干后，放在密封的塑料袋中，于低温干燥处保存备用。试验饲料组成及营养水平见表1，各试验组VE和Se的设计添加量及饲料中的实际测量值见表2。

表1 试验饲料的组成及营养水平（%）

表2 饲料中VE和Se的添加量及实际测量值（mg/kg）

1.2 试验设计

采用2×5双因子试验设计，在基础饲料中分别添加0、0.15 mg/kg的Se，每一Se水平下分别添加0、30、60、90、120 mg/kg的VE，共制成10种试验饲料A1（0,0）、A2（0,30）、A3（0,60）、A4（0,90）、A5（0,120）、B1（0.15,0）、B2（0.15,30）、B3(0.15,60)、B4（0.15,90）、B5（0.15,120）共10组，每组设3个重复,每个重复50尾，随机分配到30个100×60×60 cm3的水泥池中进行饲养试验，养殖试验从2011年6月10日至2011年8月19日，为期70 d。每天分别在9：00和17：00各饱食投喂一次，投食在1 h内吃完为基准。投喂1 h后，若池内有残饵，则结束投喂并捞出残饵，记录每次残饵量与每天余料。试验用水为曝晒去氯后的自来水，每天8：00换水1/3并记录水温。饲养期间平均水温(26.5±1.5)℃，pH值(7.1±0.1)，DO 6.0～8.0 mg/l，NH4+-N(0.03±0.01)mg/l。

1.3 样品采集

试验结束时，停饲24 h，从每个水泥池中随机挑选15尾鱼，称全鱼末体重，再进行解剖将相对应鱼的肝脏、脾脏完整分离并称重。再从池中随机挑选15尾鱼，用MS-222麻醉处理后，随即在准备好的冰盘上进行血清的采集。试验鱼通过尾静脉采取血清血样，血样分别放置在4℃静置12 h后，4℃，离心机离心10 min(4 000 r/min)，取上清液，-80℃保存备用。

1.4 生长激素和免疫等相关指标的测定

睾酮和促性腺激素含量、溶菌酶活力采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定，方法参见说明书。用日立7600-120型全自动生化分析仪测定白细胞、红细胞、总蛋白、球蛋白、白蛋白、抗体及补体C3。粗蛋白的测定采用半微量凯氏定氮法，粗脂肪采用乙醚索氏抽提法测定，粗灰分测定采用550℃马弗炉高温灼烧法，水分的测定用常压干燥法，用HPLC法检测饲料中维生素E的实际含量[13]，用荧光分光光度法检测饲料中硒的实际含量[14]。

1.5 计算公式和统计分析

肝体比（hepatic index，%）=100×（肝脏质量/终末体质量）；

脾指数（spleen index，%）=100×（脾脏质量/终末体质量）。

试验结果用SPSS 19.0软件进行双因素方差分析，多重比较采用Duncan's法进行，数据用平均数±标准差表示，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

2 结果

2.1 VE和Se对吉富罗非鱼生殖激素含量的影响（见表3）

表3 VE和Se对吉富罗非鱼生殖激素含量的影响(平均值±标准差，n=3)

由表3可知，当饲料中不添加Se时，饲料中添加VE对罗非鱼血清中睾酮和促性腺激素的影响差异显著和极显著(P＜0.05和P＜0.01)，随VE添加量的增加睾酮含量先降低后升高再降低最后回升，促性腺激素先升高后降低。VE添加量为90 mg/kg的试验组(A4)，睾酮含量最低，仅为(0.37±0.08)ng/ml，显著低于A1(对照)组的含量（1.99±0.15）ng/ml，而促性腺激素含量最高，为（106.50±5.65）mIU/ml，显著高于A1（对照）组65.4%（P＜0.05）。当饲料中添加0.15 mg/kg的Se时，Se对罗非鱼血清中睾酮和促性腺激素的影响差异显著和极显著(P＜0.05和P＜0.01)，在VE添加量范围0～90 mg/kg，加Se组睾酮和促性腺激素的含量较不加Se组低。VE添加量为120 mg/kg时，加Se组睾酮和促性腺激素的含量有所回升，但低于A（1对照）组。方差分析结果显示，VE和Se对罗非鱼血清睾酮含量的影响不存在显著的交互作用(P＞0.05)，但对促性腺激素的影响存在极显著的交互作用（P＜0.01），VE和Se会协同降低吉富罗非鱼促性腺激素的分泌。

2.2 VE和Se对吉富罗非鱼免疫功能的影响(见表4)

由表4可以看出，当饲料中不添加Se时，VE对白细胞的影响差异显著（P＜0.05），随VE添加量的增加呈先升高后降低再升高最后回落的趋势，当VE添加水平为90 mg/kg时，白细胞水平最高，显著高于A1(对照)组(P＜0.05)。VE对肝体比、脾指数、溶菌酶、红细胞、总蛋白、白蛋白、球蛋白、抗体和补体C3的影响差异不显著（P＞0.05），但当VE添加水平为90 mg/kg时，溶菌酶活力高于其它VE添加量组。当饲料中添加0.15 mg/kg Se时，Se对肝体比和脾指数的影响差异极显著(P＜0.01)，在相同的VE水平下，添加硒组的肝体比和脾指数高于不加Se组。VE添加量为0 mg/kg时，加Se后，脾指数显著高于A1(对照)组(P＜0.05)。Se对溶菌酶、白细胞、红细胞、总蛋白、白蛋白、球蛋白、抗体和补体C3的影响差异不显著（P＞0.05），但在VE添加量0～90 mg/kg，加硒组溶菌酶活力比不添加Se组高，其中硒添加量为0.15 mg/kg，VE添加量为90 mg/kg的(B4)组，溶菌酶活力最高，为(711.11±62.85)mg/ml。当VE添加量为0 mg/kg时，加Se后，白细胞、球蛋白和抗体的含量高于A1(对照)组。方差分析结果显示，VE和Se对白蛋白含量的影响存在极显著的交互作用（P＜0.01）。

表4 VE和Se对吉富罗非鱼幼鱼免疫功能的影响(平均值±标准差，n=3)

3 讨论

3.1 VE和Se对吉富罗非鱼生殖激素的影响

已有研究表明，鱼类的性激素水平与其性腺发育状态密切相关[15]，睾酮作为一种重要的性类固醇激素，是主要的雄性激素，可调节促性腺激素的分泌，与动物繁殖密切相关。本研究发现，VE对吉富罗非鱼血清中睾酮含量的影响显著，随VE添加量的增加，睾酮含量呈先降低后升高再降低最后回升的变化趋势，这与杨育州（1983）[16]、孙大江等（2004）[17]和吴湘香等（2007）[18]的研究结果相似。已有研究表明，睾酮在性别分化期间分泌较旺盛，含量往往较高，分化后迅速降低。本试验发现，睾酮水平最低的（A4）试验组个体发育较快，可能性别分化已趋于稳定，睾酮正处在迅速下降的阶段，因而睾酮含量也较低。当添加0.15 mg/kg Se后，VE添加量超过90 mg/kg，加Se组睾酮含量才回升，且比不加Se组高，说明只有VE充足的条件下，硒才会促进睾酮的分泌，这与胡双保(1987)[19]和方子龙等（1999）[20]的研究结果相似。

促性腺激素（GnRH）是一种多肽分子化合物，既能够促进脑垂体GtH的合成与释放，又能够促进生长素GH的合成，主要通过与特异性受体在脑垂体中结合而发挥生物作用，对鱼类的生殖系统调节具有重要作用[21]。本研究发现，VE和Se对罗非鱼促性腺激素的影响均显著。不加Se时促性腺激素含量随VE添加量的增加先升高后降低，VE添加量为90 mg/kg时达到最高水平，这与马兆臣（2007）[22]的研究结果类似。这可能与罗非鱼的发育阶段有关，本试验发现，A4组鱼体发育较快，可能已进入性腺发育期，处于性别分化刚稳定的阶段，体内性类固醇激素睾酮含量处于较低水平，对促性腺激素不存在反馈作用压力，因而出现较高水平的促性腺激素。当添加0.15 mg/kg Se时，随着VE添加量的增加，促性腺激素各水平组间无显著差异（VE添加量为0组除外），可能VE和Se共同发挥生物功能，保持了促性腺激素含量的稳定。

目前，关于VE和Se联合使用对吉富罗非鱼生殖激素的影响报道甚少。本试验发现，VE和Se对吉富罗非鱼促性腺激素存在极显著的交互作用，对睾酮含量不存在显著的交互作用。在VE添加量范围0～90 mg/kg，加Se组睾酮和促性腺激素的含量较不加Se组低，VE添加量达120 mg/kg，睾酮和促性腺激素的含量有所上升，但低于A1（对照）组。原因有可能是基础饲料中含有的硒已经满足罗非鱼的需要，Se是有毒元素，额外添加Se会导致过量，降低睾酮和促性腺激素的分泌，阻碍机体的生长发育，因此，VE和Se联合使用对吉富罗非鱼的生殖无促进作用。

3.2 VE和Se对吉富罗非鱼免疫功能的影响

VE和Se不仅对鱼类的生长发育等发挥着重要作用，还可提高鱼类的抗病力和免疫力[8,23]。从本试验研究结果看，VE和Se的添加，对鱼的肝体比、脾指数、白细胞、红细胞、总蛋白、白蛋白、球蛋白、溶菌酶、抗体和补体C3免疫生化指标均有不同程度的影响。

肝体比是评价肝脏是否正常的一项重要指标。肝体比过高表明可能会出现肝肿大、脂肪肝等病理症状，肝体比过低又会引起肝功能下降。脾指数是衡量营养物质与免疫功能之间关系的一个重要指标。脾指数正常，脾脏能发挥正常的免疫功能。本研究结果显示，VE对脾指数和肝体比的影响不显著，这与张琼(2004)[24]、罗辉(2006)[25]的研究结果存在差异，原因可能是试验用鱼不同、试验方法不同、规格不同、饲养周期不同、饲养管理不同导致结果的差异。添加0.15 mg/kg Se后，肝体比及脾指数均显著升高，尤其是VE添加量为0 mg/kg时，加Se后，脾指数的升高幅度达200%，可见硒能够一定程度促进鱼类的消化器官及免疫器官的生长发育，尤其是在VE不足的情况下，更突显了硒的作用，这与金明昌等（2008）[26]的研究结果基本一致，可能是因为Se作用于淋巴细胞酶系，促进淋巴细胞进行离子交换，加强淋巴细胞的功能，从而促进免疫器官的细胞分裂增殖，并且硒对细胞具有抗氧化保护作用，因而能够促进脾脏的发育。

白细胞和红细胞参与机体的非特异性免疫，高含量的白细胞和红细胞的总数被认为是动物健康的表现。在本试验中，VE的添加显著提高了吉富罗非鱼白细胞含量，不添加Se，VE添加水平为90 mg/kg时，白细胞水平最高，显著高于A1（对照）组，这与陈骋等(2010)[27]对黄颡鱼、何敏(2009)[28]对斑点叉尾鮰的研究结果一致。VE对红细胞的影响不显著，但在VE添加水平为90 mg/kg时，红细胞含量较高，这表明适宜的VE能够维持血液细胞的正常发育和形成，使鱼体维持健康状态。当添加0.15 mg/kg Se后，Se对白细胞和红细胞含量的影响不显著，但VE添加量为0 mg/kg时，Se的添加使白细胞的含量高于A1(对照)组，可见，VE缺乏时，Se能够提高白细胞数量，从而一定程度上提高了机体抗病能力。

总蛋白由白蛋白和球蛋白组成，白蛋白是衡量肝功能正常与否的一项重要指标，球蛋白是一种免疫效应分子，而抗体（IgM）是其中一种球蛋白，由淋巴细胞分泌，在机体免疫调节和防御感染中发挥重要作用，主要参与体液免疫，是一种重要的免疫因子。本试验中，VE对总蛋白、白蛋白、球蛋白、抗体（IgM）的影响不显著，其中白蛋白水平随VE添加量的升高而降低，这与何敏（2009）[28]对斑点叉尾鮰的研究及杨马（2010）[29]对鲤鱼的研究结果存在差异，原因可能是试验用鱼不同。而Se对总蛋白、白蛋白、球蛋白、抗体（IgM）的影响不显著，但在VE添加量为120 mg/kg时，添加硒的B5组白蛋白水平高于不加Se的A5组，说明充足的VE与硒联合使用才能进一步提高白蛋白水平，从而获得较好的免疫效果。

溶菌酶、补体C3是重要的体液免疫因子，是鱼类重要的非特异性免疫指标。溶菌酶可以准确反映鱼类机体对寄生虫、细菌以及病毒的抵抗能力[30]。C3是血清中含量最高的补体成分，由肝细胞、巨噬细胞、肾小球细胞、肠道上皮细胞、骨髓细胞等组织细胞合成。本试验中，VE对溶菌酶和补体C3的影响不显著，这与周立斌等（2009a、2009b）[6,31]先后对美国红鱼和花鲈的研究结果存在差异，原因可能是实验用鱼不同，规格不同及饲养管理不同导致差异。不添加Se时，VE添加量为90 mg/kg时，溶菌酶活力高于其它组，说明适宜的VE添加水平可以提高溶菌酶活力。当添加0.15 mg/kg的Se后，Se对补体C3和溶菌酶活力无显著影响，VE和Se对吉富罗非鱼溶菌酶活力的影响不存在显著的交互作用，但在VE添加量范围0～90 mg/kg，加Se组溶菌酶活力高于不加Se组，表明在一定的VE添加范围内，与Se合用能协同提高溶菌酶活力，从而一定程度提高机体非特异性免疫功能，这与张琴等（2011）[10]的研究结果基本一致。由此可见,尽管VE和Se对溶菌酶活力的交互作用没有达到统计学上的显著性，但表观数据显示存在潜在的交互作用。为了更好地揭示这种交互作用，在今后的研究中应该增加饲料中VE和Se的添加梯度，进一步全面探讨其中的变化规律。