Plexin A1在直肠癌中的表达及其意义

曾建成 黄玉梅 陈凤玲

（深圳市宝安区西乡人民医院肛肠外科 广东深圳 518102）

神经丛素（Plexins）是一种跨膜蛋白，是信号素（Semaphorins）家族的受体。Plexin Al是Plexins家族的一种亚型，具有多项潜在功能。以往对Plexin Al的研究主要集中在神经系统的发生和发展方面，近年来研究发现Plexin Al在心血管形成、免疫反应、上皮细胞生长以及肿瘤生长中都发挥着重要的作用［1～3］。本研究将Plexin A1的研究引入了消化道常见的恶性肿瘤直肠癌中，通过RT-PCR和免疫组织化学方法检测直肠癌中Plexin A1的表达，探讨Plexin A1的表达与临床病理因素之间的关系，为直肠癌的治疗和诊断提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料 收集广东医学院附属医院及西乡人民医院直肠癌患者外科手术切除标本67例，无淋巴结转移42例，有淋巴结转移25例。所有的患者手术前均未接受过任何放疗、化疗，并且经病理组织学证实。患者年龄分布在36～80岁之间，平均57±6岁，其中男39例，女28例。根据Duckes分期：A期16例，B期26例，C、D期25例。另取相应的癌旁组织（肿瘤边缘5cm以上的无肿瘤组织）45例作为对照组。所有患者均知情同意。

1.2 主要试剂 RT-PCR引物由上海生工生物公司设计并合成。逆转录PCR试剂盒和普通PCR试剂盒购自TAKARA公司。Plexin A1多克隆抗体为美国Santa Cruz公司产品，抗体工作浓度为1∶50，采用福州迈新公司免疫组化检测试剂盒。

1.3 方法

1.3.1 半定量RT-PCR （1）提取总RNA及逆转录：新鲜组织离体后，用Trizol法提取总RNA，溶于20μL DEP水中，使用核酸蛋白测定仪检测总RNA浓度。逆转录体系为20μL，加入1.5μg总RNA，用逆转录试剂盒，按照说明书操作步骤进行逆转录反应。（2）PCR扩增及电泳：取1μL逆转录产物作为模板，使用PCR扩增试剂盒，在PCR仪上进行PCR扩增。以GADPH作为参照。RT-PCR引物由上海生工生物公司设计并合成。Plexin Al引物序列：上游引物5’-TGA CTG GAC AGA CTC CAA G-3’，下游引物 5’-GAA CAC AAT CTG GTA CTC C-3’。GAPDH引物序列为：上游引物5’-CAA CTA CAT GGT CTA CAT GTT CC-3’，下游引物5’-CAA CCT GGT CAG TGT AG-3’。PCR反应体为25μL，PCR反应条件为；94℃预变性5min，94℃变性50s，58℃退火50s（GAPDH为55℃，50s），72℃延伸l min，32个循环，72℃再延伸10min。取8μL PCR产物在1.0%的琼脂糖凝胶上电泳30min，凝胶成像仪观察并拍照。

1.3.2 免疫组织化学 染色步骤采用SP法，详细步骤按照说明书进行。主要步骤：将所有标本石蜡块4μm厚石蜡切片常规脱蜡和水化，PBS（pH7.4）冲洗3次，每次3min；微波加热抗原修复；每张切片经3%H202消除内源性过氧化物酶的活性；滴加正常山羊血清封闭，室温下孵育30min；滴加Plexin A1多克隆抗体抗体（稀释度1：50），4℃过夜；PBS冲洗3次，每次3min；滴加MaxVisionTM试剂，室温孵育15min；PBS冲洗3次，每次3min；滴加DAB显色，苏木精复染，脱水，透明，中性树胶封固。

结果判定：Plexin A1蛋白主要定位于细胞质和细胞膜，胞浆或者胞膜呈现棕黄色颗粒则为阳性细胞。在高倍镜下，随机计数10个视野内的阳性细胞数和总细胞数，求出阳性细胞的百分率，并规定阳性细胞数大于或者等于10%为阳性，反之为阴性。

1.3.3 MVD计数 MVD检测方法参照Weidner［4］等报道的方法进行，第Ⅲ因子定位在血管内皮上，每个组织位点随机选取6个高倍视野，对微血管数计算，并计算其平均值作为MVD。

1.4 统计学方法 应用SPSS 11.3统计数据软件包分析。定量资料以中位数表示，统计方法采用秩和检验，临床病理特征组间Plexin A1表达情况的比较采用χ2检验。相关性分析采用Spearman等级相关检验。

2 结 果

2.1 Plexin A1mRNA表达 RT-PCR检测结果显示，Plexin Al在直肠正常黏膜和直肠癌组织中均有表达，且Plexin Al在直肠癌癌组织中的表达明显高于直肠正常黏膜中的表达（图1）。提示，Plexin Al在直肠癌组织的表达升高。

图1 Plexin A1在直肠癌中的表达

2.2 免疫组织化学检测Plexin A1在直肠癌中的表达 免疫组化结果显示Plexin A1蛋白主要定位于细胞质和细胞膜，阳性染色为细胞质和细胞膜出现棕色颗粒。如图2所示，直肠癌组织中Plexin A1呈强阳性表达，癌旁的直肠正常黏膜中呈阴性表达，该结果与RT-PCR结果一致。

图2 直肠癌组织中Plexin A1的表达（×200）

2.3 Plexin A1的表达与直肠癌临床病理因素的关 系 我们对67例直肠癌患者中Plexin A1的表达进行了分析，其中淋巴结转移者25例，未发生淋巴结转移者42例。结果发现在直肠癌淋巴结转移的患者中Plexin A1高表达，未发生淋巴结转移的患者中Plexin A1表达较低（P＜0.05）。Plexin A1的表达与直肠癌Dukes分期有相关性，随着Dukes分期的增加，Plexin A1表达也增加（P＜0.05）。此外，Plexin A1高表达的直肠癌组织MVD（51.03±8.71）显著高于Plexin A1低表达的癌组织（41.26±11.39），Plexin A1的表达与 MVD成正相关（P＜0.05）。

表1 Plexin A1表达与临床病理因素之间的关系

3 讨 论

直肠癌是我国最常见的恶性肿瘤之一。对于直肠癌的治疗，目前主要是手术切除，然而相当多的患者在术后复发或发生转移，这是直肠癌难以治愈并导致患者死亡的重要原因。直肠癌的淋巴结转移、转移远近等已被作为判断患者预后的重要指标。目前对于直肠癌的早期诊断率较低，因此探索有效的诊断标志物对于直肠癌的治疗和预后有着重要意义。

Plexin A1是表达在神经细胞表面的一个钙依赖的细胞黏附分子，是Semaphorins家族的受体。Plexin A1与细胞骨架重塑相关，在胚胎时期的大脑中大量表达，具有轴突引导作用，参与神经系统的发育［5］。Plexin A1作为Semaphorin 6D的受体，在上皮细胞迁移和心脏的形态发生过程中扮演着关键的角色，Plexin A1能够调节心内膜细胞迁移，它的缺失能够导致心室致密层变薄变小以及小梁形成缺失［1，6］。最近研究发现，Plexin A1在胃癌、舌癌和恶性胸膜间质皮质瘤等恶性肿瘤中高表达，并参与了肿瘤的发生发展过程［7～9］。我们的RT-PCR结果和免疫组化结果同样显示，Plexin A1在直肠癌中高表达，并且与淋巴结转移和Dukes分级存在相关性。

近年来许多研究表明，肿瘤血管生成与肿瘤的生长、转移有着密切的关系。MVD可以作为反映肿瘤血管生成的一个指标，也有可能成为肿瘤发生转移的指标之一［10］。Nakasaki［11］发现，MVD 与结直肠癌淋巴结转移、肝转移具有相关性。本研究结果显示，Plexin A1的表达与MVD呈正相关，Plexin A1高表达的结肠癌组织中MVD显著增加（P＜0.05）。Plexin Al可能通过调节直肠癌的血管生成参与直肠癌的发生和转移。

本研究首次报道Plexin Al在直肠癌中高表达，并且与结肠癌的转移和血管生成密切相关。检测Plexin A1的表达能预测直肠癌的转移，为直肠癌的发生发展机制提供新的研究方向。Plexin Al能否作为判定直肠癌预后因素需进一步随访研究。

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［3］Takegahara N，Takamatsu H，Toyofuku T，et al.Plexin-A1and its interaction with DAP12in immune responses and bone homeostasis［J］.Nat Cell Biol，2006，8（6）：615-622.

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［6］Toyofuku T，Zhang H，Kumanogoh A，et al.Guidance of myocardial patterning in cardiac development by Sema6Dreverse signalling［J］.Nat Cell Biol，2004，6（12）：1204-1211.

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