去甲斑蝥素诱导肿瘤细胞凋亡机制及临床应用前景的研究*

常 城 何仁胜 刘少平

（湖北省黄石市中心医院，湖北 黄石 435000）

斑蝥是我国的传统中药，有效成分—斑蝥素（CA）对多种肿瘤细胞的生长有抑制作用。临床主要用于治疗肺癌、食管癌及胃癌等，并有独特的升高白细胞作用。但因其具有强烈的泌尿系统和消化系统刺激作用，不易为患者接受。近年来研究表明，去甲斑蝥素（NCTD）对体外培养的多种消化道肿瘤细胞均有明显的杀伤作用，具有良好的抗肿瘤作用，其机制可能与干扰肿瘤细胞生长周期，抑制DNA的合成代谢，影响细胞的有丝分裂，诱导细胞凋亡有关。除此以外，NCTD 还具有抗肿瘤细胞侵袭转移的能力。本文现将近年来NCTD 抗肿瘤的作用机制及临床应用前景研究概述如下。

1 构效关系

NCTD 是由呋喃及顺丁烯二酸酐通过Diels-Alder反应合成制得，与CA 构型相同，唯1，2 位无甲基。去除斑蝥素的两个甲基后，泌尿系刺激基本消失，升白效果更明显，说明该结构中两个甲基是泌尿系刺激的主要功能团，对抗肿瘤及升白的影响则小。有实验表明CA 和NCTD 在诱导肿瘤细胞凋亡方面有相似的特性。

2 NCTD 抗消化道肿瘤的作用机制研究

2.1 抑制肿瘤细胞的增殖、促进肿瘤细胞凋亡 肿瘤是细胞增生失控引起的。正常细胞增殖与凋亡处于一个平衡状态，若细胞增殖超过凋亡，则表现出生长优势，这是肿瘤发生和发展的重要基础。李功权等［1］采用Annexin V 和PI 双染和流式细胞仪法进行凋亡检测。该实验本实验应用NCTD 10 μg/mL 处理肝癌细胞12 h后收集细胞进行凋亡检测。结果显示NCTD 处理可使27%的SMMC-7721的细胞发生凋亡，明显高于对照组（NCTD 10 μg/mL）的凋亡率7%。NCTD 处理可使30%的BEL-7402的细胞发生凋亡，也明显高于对照组的凋亡率8%，表明NCTD 对此两株肝癌细胞均有较强的诱导凋亡作用。

2.2 阻滞肿瘤细胞的细胞周期 研究表明，恶性肿瘤的无限制增殖与细胞增殖周期的失控有关，细胞周期的失控与肿瘤的发生密切相关。大量的研究发现，NCTD 可作用于细胞周期的不同时期，使细胞周期阻滞、分裂受阻从而导致细胞凋亡。目前公认的细胞周期调控模式是细胞周期在多个调控点上受到调节。其中有3个调控点最为重要，G1/S 期，G2/M 期和有丝分裂中期、后期的交界处。在这些调控点上的失控就很容易导致肿瘤的发生。到目前为止，已有3 类细胞周期调控因子被发现：细胞周期素（cyclin）、细胞周期素依赖性蛋白激酶（CDK）和细胞周期素依赖性蛋白激酶抑制物（CDKI）。Fan 等［2］将GBC-SD 细胞分为NCTD 组合对照组。MTT 法测定细胞抑制率、流式细胞仪测定细胞周期和凋亡。结果发现NCTD 能抑制细胞的增值，48 h半数致死量为56.18 μg/mL。NCTD 作用功细胞48 h后，流式细胞仪观察发现：G2/M 期细胞明显增多，而S期细胞明显减少。为进一步了解NCTD 阻滞GBC-SD细胞周期的机制，作者用RT-PCR 法检测细胞周期相关蛋白cyclin D1、p27、Cip/Kip的表达，结果提示cyclin D1、p27 mRNA 表达降低，而Cip/Kip 表达增高。结果表明，NCTD 可能是通过降低增殖相关基因cyclin D1、p27 表达和上调抑癌基因Cip/Kip的表达，通过细胞周期调控达到抑制肿瘤细胞增殖的作用。

2.3 抑制细胞DNA 及蛋白质的合成 DNA 复制起始蛋白是真核细胞起始DNA 复制所必须的调控因子，包括Cdc6、Orc、Cdtl 和Mcm2-7，其中Cdc6 蛋白具有癌基因功能，可促进细胞的恶性转化，通过抑制Cdc6 可产生抗肿瘤作用，Cdc6 已被证实可作为有效的抗肿瘤靶点。李金龙等［3］用BrdU 渗入法检测NCTD 对HeLa细胞DNA 复制的变化。结果显示：作用细胞12 h 后，BrdU 渗入受到明显抑制，表明NCTD 可抑制HeLa 细胞DNA 复制。同一实验还观察到NCTD 作用细胞24 h后，DNA 复制起始Cdc6 被降解成较小的片段。

2.4 对凋亡相关蛋白表达的影响 近年来，人们对凋亡的调控机制进行了深入的研究，并已取得一些可喜成果。现已发现一些对细胞凋亡起重要调控作用的蛋白，如Bc1-2/Bax、Caspase、Cyto C 等，这些蛋白的表达异常会促使细胞恶性增殖并阻止细胞凋亡。Bcl-2 为凋亡抑制蛋白，而Bax 功能与之相反，可加速细胞凋亡的进展。Bcl-2 通过形成同源或异源二聚体来调节细胞凋亡。当Bax 形成同源二聚体时诱导细胞凋亡；Bax与Bcl-2 形成异源二聚体时则实现了Bcl-2 抑制细胞凋亡的功能。

Li 等［4］认为NCTD 诱导人肝癌细胞的凋亡与线粒体通路有关。他们选用人肝癌细胞SMMC-7721 进行常规培养，MTT 检测细胞抑制率，流式细胞仪检测细胞 凋 亡，Westren-Blot 检 测Cyto C、Caspase C、Bax/Bcl-2、AIF 蛋白的表达。结果显示NCTD 能够抑制SMMC-7721 细胞的表达且成时间-剂量依赖性。NCTD作用细胞24 h 后，抑制凋亡的Bcl-2 蛋白表达减少，促凋亡蛋白Bax 表达增加，Cyto C、Caspase 3 表达增加。该结果提示NCTD 可能是通过诱导Bax 表达增加，使线粒体通透孔道（PT）开放，线粒体内的蛋白Cyto C被释放到细胞质中，与细胞质中的Apaf-1 及Caspase-9 前体形成凋亡小体活化Caspase-9，进一步活化Caspase 3 启动Caspase 级联，最终诱导细胞发生凋亡。

2.5 对肿瘤细胞侵袭和转移的影响 临床研究表明，许多癌症患者最终死于肿瘤的全身转移而不是原发病灶，究其原因主要是因为肿瘤细胞具有极强侵袭性，能突破正常细胞基底膜转移到其他部位形成转移灶。因此，抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡、阻止肿瘤细胞侵袭、转移便成为抗癌治疗的基本原则。趋化因子能募集特定的细胞到特定的区域，如果肿瘤细胞的趋化因子持续高表达，就有可能增加癌细胞转移的概率，研究发现，CXCR4/CXCL12生物学轴与肿瘤的发生密切。当CXCL12与CXCR4特异性结合后，便趋化相应细胞到达相应部位，从而发挥刺激肿瘤生长转移、新生血管生成、抑制机体对肿瘤的免疫效应等作用，最终形成转移性乳腺肿瘤。徐小峰等［5］通过real time PCR 和Western Blot 法检测发现，不同浓度的NCTD 对体外培养的MCF-7 细胞均具有抑制其CXCR4 mRNA 和蛋白表达的作用，且呈浓度依赖性。表明NCTD 具有抑制乳腺癌细胞迁移的作用，从而为NCTD的抗肿瘤临床应用进一步奠定了基础。

3 临床应用

3.1 抑制肿瘤 近年来NCTD 在消化道肿瘤中的应用越来越广泛，主要原因是其能较好地抑制肿瘤生长，改善症状，延长生存期，提高机体免疫功能，并且具有较小的毒副作用。因此在临床上的应用也受到越来越多的关注。临床实践表明，使用NCTD 治疗原发性肝癌可使患者食欲增加，腹胀、肝区疼痛减轻或消失，生存期明显延长。简光富等［6］采用NCTD 注射液肝内瘤体中心注射治疗原发性肝癌20例，完全缓解率10%（2例），中数缓解期1年6个月；部分缓解率60%（12例），中数缓解期10个月；稳定率20%（4例），中数缓解期9个月；进展10%（2例）。表明NCTD 治疗肝癌具有症状消失快、体重增加、中数治疗后生存期也明显延长的优点。

3.2 升高白细胞 临床研究发现NCTD 亦具有升高白细胞的作用，是目前唯一具有此作用的抗肿瘤药物。郑英兰等［7］取介入治疗的原发性肝癌患者80例，介入治疗4个月中联合给予NCTD，观察介入联合NCTD的疗效。发现治疗后实验组白细胞计数明显高于对照组，而且实验组的白细胞总数有逐渐增多的趋势，说明NCTD 有独特的升高白细胞作用。这种作用原理，早期可能是加速骨髓成熟或释放所致，后期则可能是与促造血干细胞的增殖并向粒-单系祖细胞不断分化有关。

3.3 抗纤维化 纤维化可发生于多种器官，主要病理改变为器官组织内纤维结缔组织增多，实质细胞减少，持续进展可致器官结构破坏和功能减退，乃至衰竭，严重威胁人类健康和生命。目前纤维化类疾病在临床上缺乏有效的治疗方法，寻找新的抗纤维化药物显得尤为迫切。Li 等［8］将肾小管模型SD 大鼠分为对照组、NCTD 低剂量组（每日0.05 mg/kg）、NCTD 高剂量组（每日1 mg/kg）。NCTD 每日给药1次，分别于给药后的第1 周和第8 周处死小鼠，免疫组化测FN、胶原蛋白Ⅳ、TGF-β1 和磷酸酶的表达。结果高低浓度NCTD 均能降低FN、胶原蛋白Ⅳ、TGF-β1 和磷酸酶的表达，表明去甲斑蝥素能抑制肾小管纤维化。

3.4 抗病毒 斑蝥素具有较强的抗RNA、DNA 病毒作用，内服治疗乙型肝炎，外涂治疗尖锐湿疣，均取得较好疗效。研究表明斑蝥制剂有良好的抗病毒作用，甲基斑蝥素对2.2.15 细胞株分泌的HBsAg 和HBeAg 具有抑制作用，并有一定抗HBV 病毒作用，为临床应用甲基斑蝥胺抗乙型肝炎抗病毒治疗提供理论依据［9-10］。斑蝥膏外涂治疗尖锐湿疣，由于乳膏吸收后杀死疣体中病毒，而使疣体变色、萎缩、脱落，取得非常理想的效果［11］。

4 展 望

从中药中分离有效的抗癌活性成分是寻找新抗癌药物的有效途径之一。具有疗效显著、毒性小等特点的NCTD 已被证实具有较为肯定的抗肿瘤作用。但迄今为止，对其抗肿瘤作用具体的分子机制仍不完全明确，同时还缺乏临床前多种动物模型的实验资料，包括器官特异性、剂量效应关系等，因此NCTD 要真正进入临床实验以及最终成为抗肿瘤药物仍需要进行更深入的研究。我国的斑蝥资源十分丰富，使斑蝥成为具有重大研究开发价值的药用资源，我们应更深入地研究斑蝥的药理作用，这从而发挥出巨大的社会效益和经济效益。

［1］李功权，张水军，吕建锋，等.去甲斑蝥素诱导肝癌细胞凋亡的实验观察［J］.中华医学杂志，2010，90（30）：2145-2148.

［2］Fan YZ，Fu JY，Zhao ZM，et al.Effect of norcantharidin on proliferation and invasion of human gallbladder carcinoma GBC-SD cells［J］.World J Gastroenterol，2005，11（16）：2431-2437.

［3］李金龙，蔡于琛，胡志明，等.去甲斑蝥素对肿瘤细胞DNA复制起始蛋白Cdc6的抑制作用［J］.南方医科大学学报，2010，30（8）：1851-1853.

［4］Li JL，Cai YC，Liu XH.Norcantharidin inhibits DNA replication and induces apoptosis with the cleavage of initiation protein Cdc6 in HL-60 cells［J］.Anticancer Drugs，2006，17（3）：307-314.

［5］徐小峰，陈文萍，徐玲，等.去甲斑蝥素对CXCR4表达及MCF-7 细胞迁移的影响［J］.中国生化药物杂志，2010，31（2）：122-125.

［6］简先富，林金梅，梁宝英，等.去甲斑蝥素肝内注射治疗原发性肝癌20例临床观察［J］.福建医药杂志，1990，12（6）：48-49.

［7］郑英兰，史春雷，贺延新.去甲斑蝥素治疗肝癌的临床研究［J］.河北医学，2005，11（9）：820-821.

［8］Li Y，Chen Q，Liu FY.Norcantharidin attenuates tubulointerstitial fibrosis in rat models with diabetic nephropathy［J］.Ren Fail，2011，33（2）：233-41.

［9］陆德云，王甦，赵连三.影响拉米夫定相关乙肝病毒YMDD变异的因素［J］.世界华人消化杂志，2005，13：2243-2245.

［10］Romero MR，Serrano MA，Efferth T，et al.Effect of cantharidin，cephalotaxine and homoharringtonine on ＂in vitro＂models of hepatitis B virus（HBV）and bovine viral diarrhoea virus（BVDV）replication［J］.Planta Med，2007，73：552-558.

［11］陈佐龙，毕焕州，刘瑛琦.斑蝥素乳膏外用治疗尖锐湿疣50例［J］.中医药学报，2002，30（4）：28-28.