整合素α5和α6亚基在硬皮病中的表达

黄燕静 应振华 浙江省人民医院 杭州 310014

整合素α5和α6亚基在硬皮病中的表达

黄燕静 应振华 浙江省人民医院 杭州 310014

目的：观察整合素α5和α6在硬皮病皮损区和正常人表皮中的表达情况。方法：运用免疫荧光法检测正常人和硬皮病患者皮肤中整合素α5和α6的表达。结果：α5亚基在正常人的表皮各层都有表达，基底层表达略增加，并且在胞膜和胞浆均有表达。硬皮病中各层均有α5亚基表达，基底层尤为明显，但在颗粒层为胞浆胞膜表达，在棘层和基底层基本表达在胞膜。α6亚基在正常人表皮中在表皮各层，胞膜胞浆均有表达，但以颗粒层及真表皮交界处明显。硬皮病中以棘层和真表皮交界处为主，棘层主要表达于胞膜。结论：在硬皮病皮损表皮中，整合素α5和α6亚基表达的部位和位置发生改变，从而造成细胞功能的异常。

硬皮病 整合素 免疫荧光法

硬皮病以原发性皮肤及皮下组织纤维化为特征,其发病机制主要涉及三个方面：①血管改变；②免疫系统活化与失衡；③成纤维细胞活化与纤维化[1]。其特征包括炎症细胞因子和异常产生的细胞外基质蛋白介导的纤维化[2-4]、血管损伤和自身抗体[3]。目前很多研究表明，整合素家族和细胞外基质蛋白质与皮肤的老化、表皮增生及损伤愈合、纤维化等相关[5-7]。纤维蛋白原（fibrinogen，Fb）表面黏附分子整合素家族是介导Fb-细胞外基质（ECM）间作用的主要受体，主要介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质之间的相互黏附，并介导细胞与细胞外基质之间的双向信号传导[8]。近几十年来国内外对整合素的研究较多，主要表现在肿瘤上；在硬皮病方面，有研究认为整合素及黏附分子与硬皮病皮肤的浸润和纤维化相关[9]。而有关整合素α5和α6亚基在硬皮病表皮上表达的研究较少。本研究应用免疫荧光法检测这两种亚基在硬皮病皮损区表皮及正常人表皮中的表达情况，报道如下。

1 实验材料

1.1 组织标本 2010年5月—2011年12月我院门诊及住院，符合美国风湿病学会1980年提出的硬皮病诊断标准的硬皮病患者10例，男3例，女7例，年龄20～65岁。另选择12名正常人健康皮肤为对照组，其中男4名，女8名，年龄9～71岁。根据知情同意的原则，取硬皮病患者前臂伸侧部位活动性硬化的皮肤组织，正常对照组取相同部位，去掉皮下脂肪组织。

1.2 主要药品与试剂 整合素α5、整合素α6的单克隆抗体购自SantaCruz公司。4%多聚甲醛：4克多聚甲醛溶解于100mL 0.01M PBS，60℃水浴助溶。甘油缓冲液：0.5mol/L pH8.5碳酸盐缓冲液1份+分析纯甘油9份。4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色液：按1:1 000用PBS稀释，最终浓度100ng/mL。

2 实验方法

操作步骤如下：①将皮肤标本置于恒温冷冻机的冷冻头上，加入少许OCT包埋剂，于冷室温内-25℃冷冻切片，厚度4μm，根据所备抗体切出相应数量的片子；②用冷风机将切片吹干。将切片置于盛有1%多聚甲醛液的染色缸内4℃10min，固定10min后，用0.01mmol/LPBS洗3次，每次5min；加入预热的10mM的枸橼酸钠缓冲液95℃，加热20min；用10%小牛血清封闭37℃，1h。③分别滴加整合素α5和α6的单克隆抗体（1:100倍稀释），室温过夜。PBS洗3次，每次5min。④加荧光标记的二抗避光下室温37℃孵育2h，PBS液洗3次，每次5min；⑤加入DAPI染色液覆盖切片，室温放置5min，吸除染色液，用PBS缓冲液漂洗3次，每次5min；⑥用纸巾擦去组织周边的液体，滴加缓冲甘油封片，荧光显微镜下观察拍照。

3 实验结果

3.1 整合素α5表达 整合素α5在正常人的表皮各层都有表达，基底层表达略增加，并且在胞膜和胞浆均有表达。硬皮病皮肤组织中，各层均有表达，基底层尤为明显，但在颗粒层为胞浆胞膜表达，在棘层和基底层基本表达在胞膜。见图1（封三）。

3.2 整合素α6表达 整合素α6在正常人表皮各层，胞膜胞浆均有表达，但以颗粒层及真表皮交界处明显。在硬皮病皮损表皮中，以棘层和真表皮交界处为主，棘层主要表达于胞膜。见图2（封三）。

4 讨论

整合素是由α（120～185kD）和β（90～110kD）两个亚单位形成的异二聚体。目前已发现18种α亚单位和10种β亚单位，它们按不同的组合构成24种整合素，α亚单位起调节作用，β亚单位则负责信号传导[10]。研究表明，整合素和人的正常生理活动、部分疾病相关，例如肿瘤、炎症、自身免疫和血栓形成[11]。整合素以层粘连蛋白为配体，参与形成半桥粒，在保持皮肤完整性中发挥作用[12]。α5亚基能够和Fn相连接，对血管形成和维持血管的完整性具有特殊意义，有研究指出敲除α5亚基的小鼠无法存活。因此，缺乏α5无法形成血管，α5特异性识别Fn，与之结合，可在血管新生及维持中起作用[13]。整合素α6主要与β1及β4亚单位结合，组成α6β1及α6β4，是层粘连蛋白（Laminin，LN）的单特异性受体，介导上皮细胞与基膜的黏附，在细胞的增殖与分化、信号传导[14]。关于硬皮病的发病机制仍不明确，但研究显示其与细胞外基质蛋白介导的纤维化和血管损伤密切相关[2-4]。

目前血管生成疾病有几十种，包括恶性肿瘤、感染、免疫性疾病等等，而血管内皮与基质细胞黏附分子对肿瘤血管生成的作用越来越受到关注，其中包括整合素家族[15]。近几年有关整合素与硬皮病相关性的研究较少，Iannone等[11]通过免疫荧光和流式细胞仪分析8例局限性硬皮病和5例弥漫性硬皮病的成纤维细胞，认为与正常人相比，弥漫性硬皮病皮损中α5亚基表达显著下降，α6亚基表达明显上升。本实验结果提示，整合素α5、α6亚基在硬皮病患者表皮中表达的部位和位置上的改变可能导致了角质形成细胞的功能发生变化，从而影响细胞及血管功能。本实验从整合素在皮肤结构上表达的变化更进一步说明整合素与硬皮病病变的密切相关性。

对于整合素与肿瘤之间的关系有较多的研究，包括肺癌、肠癌、乳腺癌等。研究[16]发现，在乳腺肿瘤中整合素α5亚基过度表达和α6亚基表达减少，且通过影响分子调控机制的表达从而影响肿瘤细胞周期。文献[17]报道，αvβ3是最引人关注的肿瘤血管新靶标，αvβ3在肿瘤血管上选择性地大量表达，而在正常静止的血管不表达；αvβ3介导内皮细胞与细胞外基质的黏附；整合素可以通过胞内区与黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）或非受体酪氨酸激酶相互作用，调节Rho A信号通路。αvβ3为靶标的药物已经处于临床Ⅰ期或Ⅱ期实验，用于治疗结肠癌、前列腺癌等多种肿瘤。

整合素家族与血管内皮的变化紧密联系，肿瘤及硬皮病的发病均与血管异常相关。通过整合素与肿瘤相关研究中进行延展，整合素或将成为硬皮病甚至免疫系统性疾病靶向治疗的新方向。

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The expression of Integrin α5 and α6 altered in scleroderma

HUANG Yanjing，YING Zhenhua.Zhejiang Provincial People's Hospital，Hangzhou（310014），China

Objective：To investigate the expression of integrin α5 and α6 in scleroderma and normal epidermis.Methods：The expression of integrin α5 and α6 in normal subjects and scleroderma skins were assessed by immunofluorescence method.Results：The α5 subunit in normal skin was expressed both in all layers,slightly increased in the basal and in the membrane and cytoplasm.The expression of α5 subunit in lesions of scleroderma was evidently observed in the basal layer,and was also noted in the cytoplasmic and membrane of granular layer and in the membrane of spinous and basal layers.As for the α6 subunit,its expression in normal skin was found in all layers and in the cytoplasm and membrane,with more obvious expression in the granular layer and true epidermal junction.In Scleroderma,the expression of α6 subunit was mainly in spinous layer and true epidermal junction and in the membrane of spinous layer.Conclusion：The expression of integrin α5 and α6 subunits was altered in scleroderma epidermis,resulting in cellular dysfunction.

scleroderma integrin immunofluorescence

2013-05-22

应振华，Tel：13706712139；E-mail：13706712139@126.com