肉鸽大肠杆菌的分离鉴定与耐药性的研究

柏文芳，伍清林，金兰梅＊，陈玉华

（1.金陵科技学院动物科学与技术学院，江苏南京210038；2.南京市江宁区汤山街道动物疫病防治站，江苏南京211131）

近年来，随着农村产业结构的调整，养鸽业得到了蓬勃发展，由散养发展到目前的规模饲养，因而，随着饲养数量增加和方式的改变，疾病的发生也较以前更为频繁和复杂。大肠杆菌病已经成为肉鸽重要的、常见的细菌性传染病之一［1］。在一些大型和个体肉鸽场中，由于环境卫生条件较差，时常发生大肠杆菌病，由于大肠杆菌血清型较多，且各鸽场流行菌株不同，往往给本病的免疫预防带来许多困难。此外，由于临床上缺乏检测条件，生产上盲目滥用药物，造成耐药菌株不断产生，致使对大肠杆菌病治疗效果下降，给养鸽业造成严重了经济损失。笔者对南京市郊某肉鸽饲养场在2011年9月肉鸽发生的大肠杆菌病，进行了病理剖检、病原分离鉴定及药物敏感性试验，为肉鸽规模化鸽场和养殖户在肉鸽生产中对大肠杆菌病的防治提供科学的参考依据。

1 材料与方法

1.1 鸽场饲养情况

鸽场地处长江岸边，远离居民区，无噪音源。内有8栋鸽舍，呈东西排列，笼养，水泥地面，笼架排列紧密，通风不良，湿度高，饲养有近5 000 只肉鸽。以玉米为主饲料，粪便2～3周清理一次，每周消毒一次。按正常的免疫程序进行新城疫等疫病预防。

1.2 培养基、试剂、药敏纸片等

营养琼脂（NA）、麦康凯琼脂（MAC），购于国药集团化学试剂有限公司，批号分别为20100115、20090525；S.S 琼脂、营养肉汤、伊红美蓝琼脂（EMB）、三塘铁琼脂（TSI）、肠杆菌科细菌生化编码鉴定管GYZ－15e、靛基质试剂，均购于杭州天和微生物试剂有限公司，批号分别为100915、100908、100907、100806、110222、110223；血琼脂培养基按常规方法配制（采用营养琼脂与绵羊鲜血5%混合）；卡那霉素、复方新诺明、阿米卡星、头孢曲松、诺氟沙星、强力霉素、先锋必、多粘菌素、呋喃妥因等18种药敏纸片，购于杭州天和微生物试剂有限公司，批号100823；质控菌大肠埃希氏菌ATCC25922、大肠杆菌O 因子血清等购自中国兽医药品监察所。

1.3 试验方法

1.3.1 观察临床症状和剖检 按照传染病规范要求，采用常规的方法进行流行病学调查和临床症状观察，选择不同年龄的病鸽和死鸽进行解剖，观察病理变化。

1.3.2 细菌分离培养 在解剖病鸽的同时，无菌采集心血、腹水抹片，取心脏、肝脏和脾等病变组织，剪开内切面触片进行革兰氏染色，区别阳性和阴性细菌；同时分别涂布NA 平板、MAC 平板和血琼脂平板，置37℃培养24h，观察各种培养基上菌落的形态特征。然后挑取MAC平板上单个红色的典型菌落再次接种到MAC平板上，37℃培养24h分离纯化，后再挑取单个典型菌落分别转接到EMB 平板和TSI斜面上，37℃培养24h，初步鉴定为大肠杆菌。分别挑取TSI斜面上的单个菌落，接种到营养肉汤中，37℃培养24h，获得纯培养物，进行生化鉴定。同时另挑选单个菌落涂片革兰氏染色，观察菌体形态和染色特征。

1.3.3 生化鉴定 按细菌常规生化特性试验方法进行生化试验。选取麦康凯琼脂上长的红色菌落或伊红美兰琼脂上生长出的黑色带有金属光泽的菌落，作靛基质、三糖铁、明胶液化、氧化酶、过氧化氢酶、尿素酶、MR、V－P 及糖（葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露糖、蔗糖）发酵试验，观察反应结果，确认菌株是否为大肠杆菌。并用标准菌株作参照。

1.3.4 血清型鉴定 将纯化的大肠杆菌分别接种于NA 平板，37℃培养24h后，用0.5%的灭菌石炭酸生理盐水5mL 冲洗，收集菌悬液放入灭菌的试管中，121℃高压灭菌2h，冷至室温，按中国兽医药品监察所提供的使用说明书进行抗原抗体平板凝集试验，鉴定血清型。

1.3.5 动物回归试验 将鉴定为大肠杆菌的菌株接种于营养肉汤，37℃培养18h。经细菌计数用生理盐水稀释成1.0×107CFU／mL 的菌液，按0.5mL／只颈部皮下注射20～25日龄的雏鸽（一个菌株注射一只），另取2只同龄雏鸽作为对照组，0.5 mL／只注射无菌肉汤。观察其发病和死亡情况，剖检观察病变，并进行细菌分离，对比菌落形态和生化特性［1］。

1.3.6 药敏试验 按照世界卫生组织（WHO）推荐的Kirby Bauer药敏纸片扩散法，将各株大肠杆菌的纯培养物均匀涂布于营养琼脂平板上，贴上庆大霉素等18种药敏纸片，37℃培养24h观察，量取抑菌圈的直径。依据NCCLS 有关标准，以质控菌ATCC25922为对照进行测定，只有当质控菌株的抑菌圈直径在允许范围内测试菌株结果才有效。判定标准参照美国国家临床实验室标准化委员会（NCCLS）M100－S15［2］以敏感、中介、耐药3 种形式对抑菌圈大小作出判定。

2 结果与分析

2.1 临床症状与病变

该肉鸽场鸽群每年在天气骤然变化时均要发生拉黄白色或黄绿色水样稀粪为主的症状传染病，使用强力霉素、环丙沙星、敌菌净等药物进行治疗，疫情虽然能得到控制，没有发生大批死亡，但常年零星发生。从2011年8月下旬到9月初出现死亡增多现象，以成年鸽为主，也有青年鸽和乳鸽。发病率增加到15%左右，死亡率增加到5%。病鸽表现为精神沉郁，呆立嗜睡，不愿走动，羽毛松乱，食欲减退或废绝，呼吸困难，张口呼吸，拉黄白色或黄绿色水样稀粪，肛门周围被粪便污染，极度衰竭和消瘦，个别严重腹泻的病鸽后期出现头部侧歪抽搐死亡。

共剖检14 只病死鸽，剖检变化为病鸽体腔积液，呈灰黄色混浊，接触空气后凝固；心脏呈纤维素性心包炎病变，心包膜明显增厚，不透明，包膜上的纤维素呈绒毛状，心包积有淡黄色液体，接触空气易凝固，心室扩张，心壁变薄，质地柔软，心室内有大量积血；肝肿大、淤血，肝包膜增厚，表面被覆大量黄白色的纤维素膜凝块，易剥脱，被膜下散在大小不等的出血点，肝呈紫褐色；小肠见卡他性炎症，眼观可见黏膜充血、潮红、肿胀，表面附着多量渗出物。

2.2 细菌分离

在肉汤培养基37 ℃24h培养后，呈均匀混浊，管底有淡白色粘稠沉淀，管壁液面有菌环；在MAC平板上，形成中等大小的红色菌落；在NA 平板上长出表面光滑、湿润、半透明、灰白色、圆形微凸起、中等大的菌落；在血平板上长出菌落较大，边缘整齐，并有隆起的灰白色菌落，多数不溶血；在EMB 平板上，形成带有金属光泽的黑色小菌落。取心血、腹水抹片、心脏、肝脏和脾等病变组织触片及培养物涂片染色镜检均可见两端钝圆，多数散在排列，革兰氏阴性短杆菌。

2.3 生化特性

从病死鸽体内分离的14 个分离株，经生化鉴定，均符合大肠杆菌的生化特征，能在三糖铁培养基上产酸产气使培养基变黄，均不产生H2S。对大多数糖类（乳糖、葡萄糖、麦芽糖、甘露糖、果糖）产酸产气，吲哚试验、MR 试验为阳性，V－P试验、明胶液化试验、尿素酶试验、氧化酶试验阴性，产生靛基质，MR 试验、过氧化氢酶试验阳性。以上试验证明此菌是大肠杆菌。

2.4 血清型鉴定

鉴定出的14株大肠杆菌定型其中12 株（2 株未定型）O 血清型共4 种。分别是O2、O18、O78、O101，其中O2型8株，O78型2株，O101型、O18各1株，O2为主要血清型，占血清型总数的66.67%。

2.5 动物回归试验

对照组的2只鸽无任何临床症状，扑杀后剖检，脏器无任何病变，未分离到细菌。14只注射菌液的肉鸽主要表现为精神不振，缩头呆立，不愿活动，排土黄色稀粪便。第1d死亡8只，第2d死亡4只，两天累计死亡12只，死亡率85.71%（12／14）；剖检可观察到心包积液，心包膜、心外膜有大量纤维蛋白沉着，气囊表面有大量黄白色干酪样渗出物，肝脏肿大，有针尖样出血斑。从死亡鸽的心血和肝脏组织中分离到细菌，与接种菌比较发现，菌落形态相同，生化特性也一致。

2.6 药敏试验

分离得到的14株大肠杆菌均对庆大霉素高度敏感（高敏率达100%），对卡那霉素、头孢拉定、头孢曲松、先锋必等高敏率在70%以上；对阿米卡星、呋喃妥因的敏感率在64%以上；对氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、多粘菌素的敏感率和耐药率均为50%；对红霉素、链霉素、四环素、复方新诺明、氨苄西林耐药，耐药率在57.14%～85.71%之间；对强力霉素、新霉素不敏感。结果见表1、表2。

表1 14株大肠埃希菌对18种抗菌药物敏感性试验结果Table 1 The results of 18drug sensititivity tests to 14pathogenic E.coli strains mm

表2 14株分离菌的药敏试验结果Table 2 The results of drug sensititivity tests to 14strains pathogenic E.coli

3 讨论与小结

本次试验经病原分离鉴定为大肠杆菌病。从病鸽体内分离到14株大肠杆菌，通过血清型鉴定共确定12 株，分为4 个血清型，分别是O2、O18、O78、O101，其中O28 株为主要血清型，占血清型总数的66.67%。定型的12株大肠杆菌毒力较强，从动物回归试验结果看，可使雏鸽发病率达100%，致死率100%。血清型未定的2株大肠杆菌无致病性。

大肠杆菌作为肠道常在菌，在条件变差及其他病原感染后易继发致病，并且其血清型众多、抗原复杂、容易形成耐药性，在实际生产中疫苗预防和药物防治效果不理想。目前我国畜禽大肠杆菌耐药性严重而复杂，对大多数抗菌药物都已经产生了耐药性［3］。本试验在病鸽体内分离的14株大肠杆菌对18种抗微生物药物除庆大霉素、头孢拉定、卡那霉素3种以外均产生不同程度的耐药，对强力霉素和新霉素两种药物完全耐药，说明分离菌株已经产生了比较严重的耐药性。其原因是该场鸽子发病后乱投药和长期滥用药，使耐药菌株出现的也越来越多。提示肉鸽饲养场在疾病防治中要合理用药用，重视大肠杆菌的耐药性问题。在临床治疗过程中，首先要进行药敏试验，可以选择几种比较敏感的药物合用或交替使用，以减少单一药物的使用剂量或使用时间，减少耐药菌株的产生。

大肠杆菌在环境、饲料、饮水、灰尘中均存在，据研究鸽舍中灰尘大肠杆菌含量达105～106个／g，灰尘是传播大肠杆菌病最主要的途径，封闭饲养的鸽舍内，通风不良，加上鸽子饲喂时往往拍飞而产生浮尘，这样的环境中易暴发大肠杆菌病［1］。此次鸽场大肠杆菌病的发生与其落后的饲养管理方式是分不开的。据调查鸽场内卫生状况较差，空气尘埃较多，粪便不及时清除，密度过大通风不畅，加之鸽舍建在临近河道的地方，舍内湿度大，虽然每周消毒一次，但长期使用一种消毒药，病原菌对此已经产生完全耐药（另有报道），空气环境中有大肠杆菌存在，在遇到天气骤然变化等应激因素的影响下，造成本病的发生。因此，建议鸽场平时要加强饲养管理，应从温度、湿度、环境卫生、消毒等方面采取综合的生物安全措施，做到以预防为主。

［1］赵宝华，卜 柱，徐 步，等.肉鸽大肠杆菌的分离与鉴定［J］.经济动物学报，2010，14（4）：226－227.

［2］Kh an A，Dass C，Ramam urthy T，et al.Ant ibiot ic resis tance，virulence gen e，and molecular prof iles of Sh iga toxin producin g Esch eri chia colii solat es f rom diverse s ou rces in calcutta［J］.J Clin Microbiol，2002，40（6）：2009－2015.

［3］伍清林，金兰梅，周正凯，等.动物园珍禽舍内大肠杆菌的分离鉴定与耐药性的试验［J］.中国兽医杂志2011，47（9）：24－27.