中药提取物对鸡免疫调节作用的研究

2013-01-21柳风祥徐海花

家畜生态学报 2013年3期

柳风祥，徐海花

（1.山东农业大学动物科技学院，山东泰安271018；2.山东农业大学水利土木工程学院，山东泰安271018）

中草药制剂具有安全、低毒、低残留、不易产生抗药性等优点［1］，在动物疾病的防治中起到越来越大的作用。研究表明，某些中药具有免疫增强作用，能调节机体的免疫机能，影响网状内皮系统、巨噬细胞、淋巴细胞、白细胞以及DNA、RNA、蛋白质的合成、抗体的合成［2－5］，并能使环磷酰胺所造成的免疫抑制转至正常水平。中药的活性成分很多，不同溶剂提取得到不同的活性成分，有水溶性的，有脂溶性的。本研究是在前期筛选中药配方的基础上以REV 为免疫抑制因子建立试验动物模型，对不同提取方法的中药制剂进行研究，观察对免疫抑制鸡NDV、H5－AIV 抗体水平和免疫器官重量的影响，为研究中药的免疫增强作用和对各种原因引起的免疫抑制机理与防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 复方中药组成和提取方法

黄芪（Radix Astragali）、党参（Radix Codonopis）、淫羊藿（Herba Epimedii）、甘草（Radix Glycyrrizae）均购自泰安市药材公司，经山东省兽药监察所鉴定。

试验中药物由40%黄芪、25%党参、25%淫羊藿、10%甘草混合组成复方中药，加8倍量的自来水浸泡过夜，煮沸2h后过滤，滤渣再加5倍量自来水煮沸2h过滤，合并两次滤液，煮沸去水浓缩至含中药材1g／mL，得中药提取物ACEG（以各中药英语单词第一个字母表示）。为了比较中药中水溶性或脂溶性成分的药理活性，将复方中药混合物ACEG先用乙醚浸泡，每天搅拌2 次，1 周后，过滤。将滤液中溶剂挥发后，加葡萄糖搅拌均匀，干燥，粉碎，制成含中药材1g／g，该提取物称之为ACEG－E。乙醚浸出后的药材，提取方法和中药材含量同上述水提取物的提取方法，该提取物称之为ACEG－W。

1.2 免疫抑制状态的诱发

REV－C99－p3株，为本实验室保存的一株经分子克隆化的REV 毒株［6］，1日龄雏鸡大腿内侧肌肉接种REV 病毒稀释液（500TCID50／只）。

1.3 动物试验设计

150只海蓝褐公鸡，随机分为5组，每组30只。1组为不接种病毒对照组，2～5 组为接种REV 诱发免疫抑制组。2 组只接种REV，不添加任何药物，3组和5组分别从1日龄起在饮水中按2%浓度添加提取物ACEG 和ACEG－W，自由饮水，直至试验结束。4 组按4%的浓度在饲料中添加提取物ACEG－E，拌料，自由采食，直至试验结束。

7日龄时所有鸡点眼接种Lasota株NDV 弱毒疫苗，同时肌肉接种NDV 灭活疫苗（英特威公司生产）和H5－AIV 灭活疫苗（齐鲁动物保健品有限公司生产），其中H5－AIV 为抗原浓缩型疫苗。分别在第4，5，6W 采血检测对NDV 和H5－AIV 的血凝抑制（HI）抗体水平。49日龄剖杀所有鸡统计各组体重和免疫器官重量。

1.4 数据统计学分析

以试验处理（组）为固定效应，用SAS8.2软件包的GLM 程序对各试验指标进行分析，结果用平均值±标准误差表示，组间差异性用邓肯氏多重比较进行分析。

2 结果

2.1 不同提取法中药提取物对鸡的免疫调节作用

表1中的试验结果显示，REV 极显著地诱发了试验动物的对NDV 灭活疫苗的抗体反应（P＜0.01）；添加中药水提取物（ACEG）和乙醚提取后水提取物（ACEG－W）组对NDV 灭活疫苗免疫后4w、5w、6w 的HI抗体滴度具有极显著的增强作用（相对于2组，P＜0.01），但仍然低于1组；而乙醚提取物组（ACEG－E）与2组比较差异不显著（P＞0.05）。ACEG 与ACEG－W 比较差异不显著（P＞0.05）。结果表明，ACEG 和ACEG－W 都具有免疫增强作用，而ACEGPE没有免疫增强活性，黄芪、党参、淫羊藿和甘草的免疫增强活性成分在水相。

表2中的试验结果显示，REV 同样极显著地诱发了试验动物的对H5－AIV 灭活疫苗的抗体反应（P＜0.01）；添加中药水提取物（ACEG）组对H5－AIV 灭活疫苗免疫后4w、5w、6w 的HI抗体滴度具有极显著的增强作用（相对于2组，P＜0.01），但仍然显著低于未免疫抑制组（1组）；乙醚提取后水提取（ACEG－W）组在5w 和6w 对H5－AIV 灭活疫苗显示明显的免疫增强作用（P＜0.01，相对于2组），但仍然低于未免疫抑制组1组。而乙醚提取物（ACEG－E）组与2 组比较差异不显著（P＞0.05）。ACEG 与ACEG－W 比较差异不显著（P＞0.05）。结果表明，ACEG 和ACEG－W 都具有免疫增强作用，而ACEG－E 没有免疫增强活性，ACEG 的免疫增强活性成分在水相。

表1 中药水溶性成分和脂溶性成分对鸡NDV HI抗体滴度的影响Table 1 Influence of herbal extraction of water－soluble and fat－soluble components on NDV HI titer（Log2）of chickens

表2 中药水溶性成分和脂溶性成分对鸡H5－AIV HI抗体滴度的影响Table 2 Influence of herbal extraction of water－soluble and fat－soluble components on NDV HI titer（Log2）of chickens

2.2 不同提取方法中药提取物对鸡体重、胸腺、法氏囊和脾脏重量的影响

表3试验结果表明，接种免疫抑制病毒REV组与未接种组比较显著抑制鸡的体重（P＜0.05），随饮水添加ACEG、ACEG－E 和ACEG－W 组与免疫抑制组体重比较差异不显著（P＞0.05），免疫抑制添加药物组（ACEG、ACEG－E 和ACEG－W）之间比较差异也不显著（P＞0.05），但免疫抑制用药组（ACEG）体重较大（473g），说明三种中药提取物对免疫抑制动物的体重没有影响。

REV 同样诱发了免疫器官的萎缩，对照组与免疫抑制不用药物组比较差异极显著（P＜0.01）；试验数据显示，ACEG 和ACEG－W 组可显著增加免疫器官的重量（P＜0.05），但免疫器官的重量仍低于未免疫抑制组。ACEG－E 对试验动物的免疫器官没有影响（P＞0.05）。说明ACEG 和ACEG－W有促进免疫器官生长的作用。

表3 中药水溶性成分和脂溶性成分对鸡体重、胸腺、法氏囊和脾脏重量的影响Table 3 Influence of herbal extraction of water－soluble and fat－soluble components on body weight and immune organs weight of chickens

3 讨论

传统医学《黄帝内经》说：“邪之所凑，其气必虚”，“正气存内，邪不可干”。说明无论什么疾病，都是正邪斗争的具体体现。如果机体真气（即正气，为人体生命活动的物质基础，又是动力的源泉）虚衰，不足以抵御趁虚而入的外邪，由此而变生百病。如果真气充足，邪气就不会侵入，机体生理功能旺盛，疾病也就不会发生。因此中医提出了“扶正祛邪”的基本治疗法则，按现代免疫学理论可称为“提高机体免疫功能”，这也体现了现代免疫学的朴素原理。鸡生产性能和疫病的防治是目前养鸡业公认的重点工作，也是关系到养殖户或企业经济效益好坏的重要指标之一。随着集约化程度的提高以及多重因素的交织，往往导致疫苗接种鸡后应答能力下降，使机体的抗病力下降；中草药组成的免疫增强剂就是运用扶正祛邪和扶正固本的理论，结合现代医学的新技术，来提高鸡免疫系统的免疫功能，增强抗病力，从而达到防治鸡疫病的目的。

黄芪具有补气固表，托毒排脓，生肌等功能；党参具有补气、益血、生津的功能；淫羊藿具有补肝肾、强筋骨、助阳益精、祛风除湿等功能。现代研究表明，中药的活性成分具有增加免疫器官重量、促进外周血、脾脏淋巴细胞增殖、提高雏鸡新城疫抗体效价的作用［3－6］。本试验用黄芪、党参、淫羊藿和甘草组成复方中药，并通过一定提取方法研究中药水溶性成分和脂溶性成分对体液免疫和免疫器官的影响。试验结果显示（表1和表2），由黄芪、党参、淫羊藿和甘草组成的复方中药，其水溶性成分和乙醚提取后再用水提取的成分具有明显增强由REV 诱发的免疫抑制鸡的NDV 和H5－AIV HI抗体水平，而由同样中药组成的乙醚提取成分则没有免疫增强作用，说明具有免疫增强作用的成分在水相，这和胡元亮、储岳峰、王德云的研究结果一致。中药水提取物还能提高REV 免疫抑制鸡NDV 和H5－AIV 的抗体水平，对于这方面的研究以前没有见到报道。

黄芪等提取物能提高肉仔鸡生长性能，促进免疫器官发育，增强免疫活性，增加免疫器官的重量［7－9］。形态学研究表明［10］，黄芪多糖（APS）可使小鼠脾脏增大，在光镜下观察，腹腔注射APS后小鼠脾脏中血髓增大、淋巴结增多。在电镜下观察，用过APS的小鼠脾脏中有大量成浆细胞增生，以成熟浆细胞为主，核内染色质凝集成块，胞浆内有大量粗面内质网，内质网呈不同程度的扩张，腔内充满中等或低电子密度的抗体蛋白质。本试验中中药水溶性成分具有明显的增加REV 诱发的免疫抑制鸡的胸腺、法氏囊和脾脏的重量，说明该中药组合的水溶性成分具有促进免疫器官生长发育的作用；但是由同样中药组成的乙醚提取物对REV 诱发的免疫抑制鸡的免疫器官没用影响。说明该中药组合的水溶性成分对REV 诱发的免疫抑制鸡的免疫器官的发育有促进作用，具有促进作用的成分在水相。

研究表明，中药水溶性提取物主要含有多糖、鞣酸、苷类、氨基酸、微量元素、胡萝卜素叶酸等，其中多糖是主要的免疫活性成分，具有免疫增强作用［11－12］。本试验中不论是直接用自来水提取还是用乙醚提取后再用自来水提取的药物都具有免疫增强作用，主要是由于水提取物中含有多糖的原因，多糖不溶于乙醚，所以乙醚提取物没有多糖，其免疫活性最差，所以对REV 造成的免疫抑制增强效果最差。从试验结果中发现，三种中药提取物中，水提取物的免疫增强效果比较明显，而用乙醚提取的效果最差，说明溶于水的黄芪多糖、党参多糖、淫羊藿多糖和甘草多糖起到了免疫增强作用。