HO-1 siRNA表达载体的构建及其稳定转染SGC7901细胞系的建立

张涛，白芳云，白飞虎

(1.宁夏医科大学，宁夏银川 750004;2.宁夏医科大学总医院，宁夏银川 750004)

血红素加氧酶(heme oxygenase，HO)是血红素分解代谢过程中的限速酶，人体内的CO主要是由HO代谢产生的。目前认为HO有3种形式:氧应激诱导型(HO-1)、组成型(HO-2)及尚未明确的HO-3。HO-1是血红素降解的一种限速酶，其将血红素分解产生CO、Fe2+和胆绿素。研究表明，HO-1不仅在机体生理状态下发挥作用，更主要的是在机体非正常状态或应激状态中发挥作用。大量研究证实HO-1参与体内各种氧化应激损伤及炎症反应，发挥抗炎、抗凋亡及细胞保护作用［1］。近年来大量研究发现，HO-1与肿瘤增殖、血管发生、凋亡等生物学行为密切相关［2］。本实验将通过构建抑制HO-1表达的siRNA表达载体，脂质体转染SCG7901细胞，利用G418筛选稳定转染的细胞系并进行筛选鉴定，为进一步进行HO-1在肿瘤发生过程中可能存在的相关机制研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

感受态大肠杆菌E．coli DH5α和SGC7901细胞为第四军医大学西京消化病医院实验室制备和保存;高保真PyrobestTMDNA聚合酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ购自TaKaRa公司;RTPCR反应试剂盒及质粒提取试剂盒购自北京天根生物公司;PCR引物由Invitrogen公司合成;转染试剂Lipofectamine 2000为Invitrogen公司产品;RPMI 1640培养液为Hyclone产品;新生牛血清购自杭州四季青责任有限公司;G418购自Amresco公司;DEPC购自上海生工生物工程技术服务有限公司;总RNA提取Trizol购自Promega公司;兔抗人HO-1单克隆抗体和兔抗人β-actin单克隆抗体购自EPITOMICS公司;辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG-HRP购自TakaRa公司。

1.2 主要仪器

二氧化碳(CO2)培养箱:3110 SeriesⅡ水套，美国Thermo Scientific公司;超净工作台:单人单面VS-840-1，苏州净化设备仪器厂;倒置荧光显微镜:IXTIA22FL/PH，日本 Olympus。

1.3 表达载体的构建和鉴定

参照本小组前期实验［3］合成1条 HO-1小干扰RNA序列AACTTTCAGAAGGGCCAGGTG;将合成的目的基因片段与pEGFP-C1载体连接，转化感受态细菌DH5α，提取质粒用紫外分光计测定A260/A280值和浓度，内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳初步鉴定，并送南京金斯瑞生物技术有限公司测序进一步验证。按照相同的方法，制备1个阴性对照表达载体，序列为GTTCTCCGAACGTGTCACGTA。

1.4 G418筛选浓度的测定

将处于对数生长期的SGC7901细胞用胰酶消化吹悬后计数，按照每孔2 000个细胞接种于24孔板，加入含有不同浓度的G418的完全细胞培养液(浓度梯度为 0、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1 000、1 100 μg·ml-1)，并各做 1 个复孔，培养约 7 d后可见各组均有细胞死亡，培养14 d后可见600 μg·ml-1G418及更高浓度组细胞均死亡，而其他组虽也有细胞死亡但未完全死亡，因此确定G418筛选浓度为 600 μg·ml-1。

1.5 转染和加药筛选

细胞培养用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，在37℃条件下、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。转染前24 h接种SGC7901细胞至24孔板，每孔细胞约2.0×105个，转染时细胞融合度达到80% ～90%。按照Lipofectamine 2000说明书配制质粒和脂质体复合物，转染体系为200 μl，每孔终体积为500 μl，放入37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中继续培养6 h后换液，同时设立空白对照组以及阴性对照组，空白对照组以等量培养基代替转染体系，阴性对照组中加入阴性对照表达载体。转染细胞培养48 h后加入含有G418的筛选培养基继续培养。

1.6 稳定转染细胞的单克隆化

加压筛选后，每3 d更换1次培养液，约20 d后开始出现细胞克隆，40 d后可见成簇生长的细胞零散在培养孔中，小心消化吹散使其在培养孔中扩大培养，待到阳性细胞长满培养孔后获得混合克隆。随后按照有限稀释法进行单克隆化操作:预先对96孔板除第1排之外的所有孔加入100 μl培养液，接着将混合克隆稀释至1 ×106个·L-1，按 200 μl·孔-1接种于 96 孔板的第1排，从中吸取100 μl细胞液接种于第2排，混匀后，从第2排中吸取100 μl接种于第3排，直到第8排，最后1排均丢弃100 μl细胞液，待细胞贴壁生长后，倒置显微镜下观察，标记只含有1个细胞的培养孔，每天记录细胞生长情况，约15 d后，挑选单克隆细胞株进行培养。

1.7 RT-PCR检测HO-1转录水平的表达

用Trizol一步法提取细胞总RNA，反转录制备cDNA，进行PCR反应。利用prime5.0软件设计HO-1上下游引物，上游引物5'-GGAGGAGGAGATTGAGCG-3'，下游引物5'-GGATGTTGAGCAGGAACG-3'，扩增产物大小为452 bp。内参基因GAPDH的上游引物5'-ATC ACCATCTTCCAGGAGCGA-3';下游引物5'-AGCCTTCT CCATGGTGGTGAA-3'，扩增产物大小为105 bp。扩增条件:95℃预变性5 min，95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃ 延伸 30 s，45个循环，最后 72℃ 延伸10 min。PCR产物以1.0%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下拍照。

1.8 蛋白质印迹法检测HO-1翻译水平的表达

用6MM培养皿培养细胞，待细胞长满后，预冷PBS洗2～3次，每个培养皿中加200 μl蛋白裂解液(含蛋白酶抑制剂)，冰上作用5 min，超声充分碎裂，4℃ 12 000 r·min-1离心5 min，用BCA法进行蛋白定量，再加入5×上样缓冲液煮沸5 min，离心后-80℃冻存备用。10%SDS-PAGE电泳，恒流20 mA 60 min电泳，半干法进行转膜20 V 25 min。用含10%脱脂奶粉的TBST室温封膜1 h，按照1∶500封闭一抗4℃摇床过夜，次日室温复温1 h，TBST洗膜4次，每次4 min，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗(稀释度1∶1 500)，摇床70转，室温封闭1 h，TBST洗膜4次，每次4 min。ECL试剂暗室曝光显影。

2 结 果

2.1 酶切及测序结果

对提取的质粒进行定量，浓度为 0.45 μg·μl-1，A260/A280=1.9，双酶切后琼脂糖凝胶电泳结果见图1。

图1 琼脂糖凝胶电泳结果

2.2 转录水平的表达

采用RT-PCR检测HO-1 mRNA表达水平，结果表明转染干扰载体的细胞表达水平明显下调(图2)。

图2 RT-PCR检测转录水平的表达

2.3 翻译水平的表达

采用蛋白质印迹法检测HO-1蛋白表达水平，结果表明转染干扰载体的细胞表达水平明显下调(图3)。

图3 蛋白质印迹法检测翻译水平的表达

3 讨 论

脂质体2000是一种阳离子制剂，其功能是通过与核酸复合发挥作用，使其能够克服细胞膜的静电作用而被细胞吸收，可以将核酸物质转染进入绝大部分的细胞系中［4］。但是针对不同的细胞系，其转染效率并不尽相同，有时候会表现得非常低，如果此时在瞬时转染条件下进行相关实验，结果往往不尽人意，有人已经证明瞬时转染和稳定转染条件下，对细胞所产生的影响并不相同［5］。相比而言，稳定转染会比瞬时转染带来更好、更稳定和更理想的实验结果，所以我们有必要进行稳定筛选来建立稳定转染的细胞系。

HO-1与肿瘤的关系日益受到关注，研究表明，与周围的正常组织相比，HO-1 在肝癌［6］、黑素瘤［7］、前列腺癌［8］、Kaposi肉瘤［9］、胰腺癌［10］中表达上调;而抑制HO-1的表达，利用锡原卟啉(SnPPIX)抑制HO-1的活性或siRNA靶向敲除HO-1表达的黑素瘤细胞增殖力缺失［7］，可降低胰腺癌、肺癌、肝癌的生长［11］。

本课题组前期的实验研究已经证明，HO-1与胃癌的发生发展关系紧密，尤其是在胃癌腹膜转移的过程中，可能发挥着促进的作用［3，12］。为了进一步研究，我们建立稳定转染的HO-1小干扰RNA的细胞系，以明确HO-1与胃癌及其腹膜转移之间的关系以及可能存在的分子机制。

［1］许俊，秦旭平.血红素加氧酶与炎症性疾病［J］.生命的化学，2010，30(5):770-773.

［2］刘立青，张黎，程力，等.HO-1与肿瘤的发生发展［J］.中国现代普通外科进展，2010，13(1):57-59.

［3］祁妮娜，白飞虎.血红素加氧酶-1小干扰RNA对人胃癌9811-P细胞体外侵袭的影响［J］.中国现代医学杂志，2011，21(17):1953-1957.

［4］DALBY B，CATES S，HARRIS A，et al.Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent:primary neurons，siRNA，and high-throughput applications［J］.Methods，2004，33(2):95-103.

［5］贺涛，张玲，崔宏，等.瞬时转染和稳定转染对RNAi抑制肝癌细胞系EGHC9901 AFP基因表达的影响［J］.军医进修学院学报，2010，31(11):1134-1136.

［6］DOI K，AKAIKE T，FUJII S，et al.Induction of haem oxygenase-1 nitric oxide and ischaemia in experimental solid tumours and implications for tumour growth［J］.Br J Cancer，1999，80(12):1945-1954.

［7］WAS H，CICHON T，SMOLARCZYK R，et al.Overexpression of heme oxygenase-1 in murine melanoma:increased proliferation and viability of tumor cells，decreased survival of mice［J］.Am J Pathol，2006，169(6):2181-2198.

［8］MAINES M D，ABRAHAMSSON P A.Expression of heme oxygenase-1(HSP32)in human prostate:normal，hyperplastic，and tumor tissue distribution［J］.Urology，1996，47(5):727-733.

［9］MCALLISTER S C，HANSEN S G，RUHL R A，et al.Kaposi sarcoma-associated herpesvirus(KSHV)induces heme oxygenase-1 expression and activity in KSHV-infected endothelial cells［J］.Blood，2004，103(9):3465-3473.

［10］SUNAMURA M，DUDA D G，GHATTAS M H，et al.Heme oxygenase-1 accelerates tumor angiogenesis of human pancreatic cancer［J］.Angiogenesis，2003，6(1):15-24.

［11］惠亮亮，白飞虎.血红素加氧酶-1对肿瘤生物学行为的影响研究进展［J］.第四军医大学学报，2009，30(20):2245-2247.

［12］惠亮亮，白飞虎，杨力，等.血红素氧合酶-1在胃癌腹膜转移中的表达及意义［J］.中华消化杂志，2009，29(9):521-524.