胸腺肽联合狂犬病疫苗接种对机体产生γ-干扰素、白细胞介素-2和中和抗体影响的研究

顾小军，沈玲，黄英

(东南大学附属第二医院内科，江苏南京 210003)

狂犬病是由狂犬病病毒引起的人畜共患传染病，病死率100%，全世界每年有6万人死于该病［1］，近几年每年约1 200～1 500万人接受狂犬病病毒暴露后接种［2］。目前降低暴露后病人发病最关键和最有效的方法就是实施暴露后狂犬病疫苗免疫。在紧急暴露患者，特别是潜伏期较短的患者，如何使机体尽快产生抗狂犬病病毒的保护性中和抗体，或者在抗体产生前机体具有一定的抵抗力是直接关系到免疫成败的关键［3］。有研究［4-5］显示胸腺肽可加强狂犬病疫苗的接种效果，我们使用单剂量胸腺肽联合狂犬病疫苗进行接种，对其增强狂犬病疫苗的疗效进行了观察和研究。

1 对象和方法

1.1 研究对象及分组

狂犬病暴露后的人群中Ⅱ级咬伤者100例，年龄18～59岁，身体健康，无不良嗜好。分成疫苗组50例，单独给予狂犬病疫苗 2.5 U，按 0、3、7、14、28 接种;胸腺肽组50例，在疫苗组基础上首针加用单剂量胸腺肽50 mg肌肉注射。

1.2 试剂

胸腺肽50 mg·支-1，长春普华制药生产;狂犬病疫苗2.5 U·支-1，赛诺菲巴斯德公司生产。

1.3 实验方法

在注射前(D0)、注射后7 d(D7)、注射6个月、注射12个月测定外周血淋巴细胞总数、γ-干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-2(IL-2)水平，在注射后7 d、注射6个月、注射12个月测定中和抗体水平。外周血淋巴细胞总数采用全血细胞计数仪计数，由本院检验中心完成。IL-2和IFN-γ含量测定采用双抗夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)测定，试剂购自上海森雄科技实业有限公司，严格按照试剂盒说明书操作。IL-2最低检测值为＞16 pg·ml-1，IFN-γ 最低检测值为 ＞8 pg·ml-1。中和抗体测定采用快速荧光灶抑制试验(RFFIT)，按参考文献［6］使用的方法检测，具体操作由武汉生物制品研究所进行。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 实验前后两组外周血淋巴细胞总数比较

两组组内及组间各时间点外周血淋巴细胞总数无差异(P＞0.05)，见表1。

表1 各组外周血淋巴细胞测定结果(±s)×109L－1

表1 各组外周血淋巴细胞测定结果(±s)×109L－1

组 别 不同时间点淋巴细胞总数D0 D7 M6 M12疫苗组2.04±0.57 1.95±0.49 2.04±0.39 2.01±0.42胸腺肽组1.97±0.65 1.93±0.38 1.98±0.36 1.87±0.31

2.2 两组不同时间点血清IL-2水平的比较

疫苗组在注射后6个月IL-2水平升高，与注射前、注射后7 d相比差异有统计学意义(P＜0.01);注射后12个月IL-2水平恢复至注射前水平，与注射后6个月相比差异有统计学意义(P＜0.01)。胸腺肽组IL-2水平在注射后7 d开始升高(P＜0.01)，7 d与6个月差异无统计学意义(P＞0.05);注射后12个月下降至注射前水平，与注射后7 d、6个月比较，差异有统计学意义(P＜0.01)。两组间IL-2的水平在注射前、注射后6个月、12个月差异无统计学意义(P＞0.05)，注射后7 d胸腺肽组IL-2水平与疫苗组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

表2 两组不同时间点 IL-2水平的比较(±s，n=50) pg·ml－1

表2 两组不同时间点 IL-2水平的比较(±s，n=50) pg·ml－1

与同组M6比较，a P＜0.01;与同组D7及M6比较，b P＜0.01;与疫苗组同时点比较，c P＜0.01

组 别不同时间点IL-2的水平D0 D7 M6 M12疫苗组 62.00±13.07a 59.83±8.35a 70.76±12.44 60.26±13.10a胸腺肽组 59.79±15.50b 65.53±14.00c 70.27±11.90 58.70±17.03b

2.3 两组不同时间点IFN-γ水平的比较

疫苗组IFN-γ水平在注射后7 d明显升高，与注射前比较差异有统计学意义(P＜0.01)，注射后6个月与注射后7 d相比，IFN-γ水平有所下降(P＜0.05)，注射后12个月降至注射前水平。胸腺肽组注射后7 d及6个月，IFN-γ水平明显升高(P＜0.01)，注射后12个月恢复至注射前水平。胸腺肽组IFN-γ水平在注射后7 d明显高于疫苗组(P＜0.05)，其它时间点两组差异无统计学意义(P＞0.05)。见表3。

表3 两组不同时间点IFN-γ的比较(±s，n=50)pg·ml－1

表3 两组不同时间点IFN-γ的比较(±s，n=50)pg·ml－1

与同组D7比较，a P＜0.01，b P＜0.05;与同组M6比较，c P＜0.05;与同组D7、M6比较，d P＜0.01;与疫苗组同时点比较，e P＜0.05

组 别不同时间点IFN-γ水平D0 D7 M6 M12疫苗组 15.35±3.03ac 17.92±2.66c 16.67±3.50b 14.72±2.91ac胸腺肽组 15.49±1.85d 19.05±2.73e 16.57±2.24 14.90±1.98d

2.4 两组不同时间点抗狂犬中和抗体水平的比较

两组组内各时间点比较，中和抗体水平差异均有统计学意义(P＜0.01);胸腺肽组在注射7 d时中和抗体水平明显高于疫苗组(P＜0.01)，在注射后6个月和12个月与疫苗组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表4。

表4 两组不同时间点抗狂犬病中和抗体水平的比较(±s，n=50) IU·ml－1

表4 两组不同时间点抗狂犬病中和抗体水平的比较(±s，n=50) IU·ml－1

同组不同时点相比，a P＜0.01;与疫苗组同时点相比，b P＜0.01

组 别 不同时间点中和抗体水平D7 M6 M12疫苗组 0.46±0.11a 4.07±1.13a 0.68±0.38a胸腺肽组 0.51±0.13ab 4.55±1.37a 0.72±0.21a

在注射后7 d疫苗组中和抗体水平＞0.5 IU·ml-1病例数为3例，胸腺肽组为10例，胸腺肽组抗体产生率高于疫苗组(χ2=4.33，P＜0.05)。在注射后6个月两组都能产生有效抗体，阳性率差异无统计学意义(P＞0.05)，12个月时抗体都有下降，两组间差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.5 IL-2、γ-IFN和中和抗体的动态变化

两组体内IL-2水平在注射后7 d开始上升，到6个月时进一步上升，到12个月时基本恢复正常，见图1。

图1 两组血清IL-2水平的动态变化

两组体内IFN-γ在注射后7 d上升明显，到6个月时仍高于接种前，到12个月时恢复正常，见图2。

图2 两组血清IFN-γ水平的动态变化

两组中和抗体在接种后7 d即有上升，6个月时最高，12个月时下降明显，但高于7 d时的水平，见图3。

图3 两组血清中抗狂犬中和抗体水平的动态变化

2.6 中和抗体和其他指标的相关性

疫苗组中和抗体与IL-2水平的 Pearson值为0.395(P＜0.01)，与淋巴细胞总数的 Pearson值为0.146(P＞0.05)，与 IFN-γ的 Pearson值为0(P＞0.05)。

胸腺肽组中和抗体与IL-2水平的Pearson值为0.235(P＜0.01)，与淋巴细胞总数的Pearson值为0.022(P＞0.05)，与 IFN-γ的 Pearson值为 0.011(P ＞0.05)。

2.7 疫苗和胸腺肽的安全性评估

所有病例皆无明显的不良反应，注射部位红肿23例(疫苗组11例，胸腺肽组12例)，低热15例(疫苗组7例，胸腺肽组8例)，乏力12例(疫苗组7例，胸腺肽组5例)，无其他严重不良反应，两组比较不良反应发生率差异无统计学意义(P＞0.05)。

3 讨 论

研究显示，狂犬病病毒暴露前免疫接种有利于狂犬病的预防［7］。对于狂犬病紧急暴露后的处理措施，目前降低暴露后人群发病最关键和最有效的方法就是实施暴露后狂犬疫苗免疫。患者在紧急狂犬病暴露时，尤其是明确的狂犬咬伤，要严格遵照动物咬伤的处理顺序，局部伤口处理、疫苗接种和抗狂犬血清/免疫球蛋白缺一不可，Ⅱ级伤口使用狂犬疫苗，Ⅲ级伤口使用狂犬疫苗加抗狂犬免疫球蛋白。但尽管如此，在全国各地仍有严格按照预防接种程序处理后仍然发病的病例发生［8］，其中免疫功能低下［9］、有慢性消耗性疾病等都会影响抗体的产生［10］。在紧急暴露人群，特别是潜伏期较短者，如何使机体尽快产生抗狂犬病病毒的保护性中和抗体，或者在抗体产生前机体具有一定的抵抗力是直接关系到免疫成败的关键。

胸腺肽是一种很好的免疫调节剂，主要增强机体的免疫功能，能连续诱导T淋巴细胞分化、成熟、发育，使CD4+T细胞数目增加;增强IL-2受体的表达，增强自然杀伤细胞的能力，调节内分泌。不同剂量的胸腺肽对机体免疫功能的调节也不同，较低剂量产生免疫促进作用，较高剂量产生免疫抑制作用［11］。Cardenas等［12-13］研究发现在小鼠感染狂犬病模型中，胸腺是最易受伤的的淋巴器官，小鼠死亡前胸腺细胞呈现高水平的CD4或CD8表达，胸腺萎缩明显，淋巴细胞凋亡。免疫低下或胸腺萎缩的人群接种疫苗效果较差［14］。史秀山等［4-5］使用小鼠研究发现加用单剂量胸腺肽(2 mg·只-1)后抗体效价高且抗体产生时间早，抗体水平高，减少免疫次数;而使用转移因子则只能增强狂犬病疫苗免疫的效果，不能减少免疫次数。我们使用单剂量(1 mg·kg-1)胸腺肽联合狂犬病疫苗对Ⅱ级咬伤的狂犬病暴露后人群进行预防接种，动态观察IL-2、INF-γ水平和中和抗体含量的变化，发现其能促进注射后7 d中和抗体的产生，但不能延缓抗体的有效保护时间。

IL-2可作用于T细胞、B细胞，调节B细胞的分化、增殖及功能，在疫苗接种产生相应抗体的过程中起着重要作用［15］，如能够降低免疫缺陷患者接种疫苗的副反应，提高免疫的效果［16］，使小鼠产生抗体的时间提前，抗体效价高［17］;因此，接种狂犬疫苗后体内IL-2的水平可以用于评价狂犬病疫苗的保护力［18］，犬接种狂犬病疫苗后体内IL-2、IFN-γ水平皆出现明显上升［19-21］。

在本次研究中，两组接种疫苗后机体IL-2和IFN-γ水平皆有明显上升，加用单剂量胸腺肽能增加接种7 d后的抗体含量，加快抗体产生的速度，对于狂犬病暴露者胸腺肽是安全的，可作为一种免疫增强剂用于狂犬病疫苗接种。

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