内皮祖细胞在早期急性肾缺血再灌注损伤中的抗凋亡作用观察

陈波，薄成佳，贾瑞鹏，朱佳庚，李文成，吴然，刘昊，葛余正

(1.东南大学医学院，江苏南京 210009;2.南京医科大学附属南京第一医院泌尿外科，江苏南京 210006)

急性肾功能衰竭是临床上常见的急危重症，缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury，IRI)是其主要原因之一，病死率可高达50% ～80%［1］。近年来，随着再生医学的蓬勃发展，干细胞在急、慢性肾脏疾病治疗中的应用正日益受到关注。内皮祖细胞(endothelial progenitor cell，EPC)作为一种具有定向归巢、增殖、分化为成熟内皮细胞特性的多能干细胞，在缺血性心脏病、急性肺损伤、高血压病等多种疾病的治疗领域发挥了重要作用［2-4］。Patschan 等［5］报道，由缺血性损伤动员的EPC可对肾脏缺血组织产生保护性作用，但其研究未涉及EPC在抗细胞凋亡方面的作用。因此，我们拟观察同种异体EPC移植对肾IRI急性期的治疗效果并探讨其可能机制。

1 材料和方法

1.1 材料

雄性SD大鼠［购自南京医科大学实验动物中心(SPF级)］;EGM-MV培养基(Lonza公司);淋巴细胞分离液(上海华精生物高科技有限公司);胰酶/EDTA(Gibco公司);兔抗大鼠血管内皮生长因子(VEGF)多克隆抗体(Santa公司);TUNEL凋亡检测试剂盒(Roche公司);蛋白质印迹检测试剂盒(Bio-Rad);CM-Dil(氯甲基苯甲酰氨荧光染料V-228888)、二甲基亚砜(DMSO，Sigma公司)。

1.2 实验动物及分组

健康雄性SD大鼠30只，体重230～250 g，随机分为EPC移植组(EPC组)、缺血再灌注损伤组(IRI组)和假手术组，每组10只。EPC组:游离双侧肾蒂，夹闭双侧肾蒂45 min，恢复血流灌注后股静脉注入0.5 ml经CM-Dil标记的 EPC悬液(细胞密度1.0×106L-1);IRI组:游离双侧肾蒂，夹闭双侧肾蒂45 min，恢复血流灌注后股静脉注入0.5 ml生理盐水;假手术组:游离双侧肾蒂，暴露45 min后股静脉注入EPC悬液(剂量同EPC组)。分别于建模后72 h处死各组大鼠。

1.3 EPC的分离、培养、鉴定和标记

Ficoll密度梯度离心法获取SD大鼠骨髓源性单个核细胞。健康雄性SD大鼠，体重130～150 g，大鼠颈椎脱臼处死，于无菌条件下获取股骨和胫骨，PBS液冲出骨髓组织，将冲洗液轻置于淋巴细胞分离液上，2 500 r·min-1离心 30 min，取中间相细胞层，PBS 清洗2次，加入EGM-2MV培养基制成细胞悬液［6］，细胞计数后加入25 cm2培养瓶(纤维连接蛋白包被)，于37℃、体积分数为5%CO2细胞培养箱中培养，10 d后可进行免疫组织化学染色(CD31、CD34、Ⅷ因子)鉴定 EPC 及细胞活力［7］。

1.4 EPC的标记

DMSO 溶解CM-Dil，配成1 g·L-1的分装溶液。取CM-Dil分装溶液 1 μl，PBS 液稀释至2 mg·L-1，重悬于收集培养10 d的EPC沉淀(细胞密度为1.0×106L-1)中，细胞接种至25 cm2培养瓶中，37℃孵育5 min，4 ℃再孵育15 min［8］，然后于荧光显微镜下观察标记后的EPC特征。

1.5 观察内容和检测指标

1.5.1 肾功能的测定 分别于肾IRI后24、48 h从大鼠尾静脉采血，分离血清后置于-20℃冰箱保存，使用日立全自动生化分析仪酶法测定大鼠尿素氮(BUN)和肌酐(Scr)浓度。

1.5.2 肾组织病理学检查及EPC示踪 左肾固定、脱水、透明、包埋、切片、HE染色，进行病理分析;右肾行冰冻切片，在荧光显微镜下观察EPC的归巢情况。肾小管损伤定义为肾小管坏死或刷状缘脱落、管型形成、管腔扩张，每张切片计算10个视野(×200)。按受损比例进行肾小管间质损伤程度评分(HSK):无病变为0分;＜25%为1分;25%≤损伤比例＜50%为2分;50%≤损伤比例＜75%为3分;≥75%为4分。分值越高表示损伤越重。

1.5.3 细胞凋亡检测 采用脱氧核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)法检测，按试剂盒说明书操作，凋亡指数(apoprotic index，AI)采用以下方法计算:每张切片至少计数500个细胞，以每100个细胞内的阳性细胞数作为凋亡指数，用百分数表示。

1.5.4 蛋白质印迹检测 提取组织蛋白，测定蛋白浓度，蛋白上样，行PAGE电泳。转膜，封闭，兔抗大鼠VEGF多克隆抗体4℃孵育过夜，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗，曝光、显影、成像。应用Image J图像分析软件对特异性条带进行吸光度分析。

1.6 统计学处理

2 结 果

2.1 EPC分离、培养、鉴定、标记及其在IRI肾组织的分布

EPC的形态学特征:新获取的大鼠骨髓源性单个核细胞呈圆形，大小不一，胞质透亮，胞核清晰。培养2～3 d后即可良好贴壁，4～8 d时细胞呈三角形、梭形或不规则形，并出现细胞集落，14 d时呈现EPC特有的条索状或铺路石状，细胞形态规则，生长稳定。每代生长时间为4～6 d，待细胞融合到80%进行传代，可获得大量的、稳定的 EPC［7］。

采用倒置荧光显微镜观察培养的EPC，在绿色光的激发下，CM-Dil标记的EPC发出红色荧光，而未标记的EPC未发出红色荧光，提示已成功标记了EPC，标记率接近100%(图1A)。移植组肾组织冰冻切片示:EPC移植后72 h可见CM-Dil阳性细胞弥散分布在肾脏皮髓交界处，发出红色荧光，形态与培养的EPC符合(图1B)。而IRI组和假手术组组未见CM-Dil阳性细胞，提示细胞来源于经股静脉移植入大鼠体内的EPC。

图1 EPC标记和示踪Fig 1 EPC labeling and trace

2.2 EPC对IRI后肾功能的影响

肾 IRI后24 h，EPC 组、IRI组大鼠 BUN、Scr水平较假手术组显著升高;肾IRI后48 h，EPC组、IRI组大鼠BUN、Scr水平仍高于假手术组;且 EPC组大鼠BUN、Scr水平较同一时间点的IRI组均有显著降低，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。

肾IRI后24 h，移植组与 IRI组比较，BUN:F=11.968，P ＜0.05;Scr:F=14.269，P ＜0.05。移植组与假手术组比较，BUN:F=101.128，P＜0.01;Scr:F=17.142，P ＜0.05。肾 IRI后48 h，移植组与 IRI组比较，BUN:F=26.32，P ＜0.01;Scr:F=14.269，P ＜0.05。移植组与假手术组比较，BUN:F=15.366，P＜0.05;Scr:F=16.651，P ＜0.05。

2.3 EPC对IRI后肾组织损伤的影响

肾IRI后72 h，HE染色示假手术组肾组织结构正常，IRI组大鼠肾脏病理损伤显著，主要集中于皮髓交界和外髓的近端小管，表现为小管上皮细胞坏死、脱落、空泡变性，刷状缘脱落明显，部分肾小管基膜裸露形成裸膜，管腔中可见脱落的小管上皮细胞，间质水肿，炎症细胞浸润。EPC组亦可见空泡变性，但肾组织损伤程度较对照组明显减轻(图2)。

图2 肾组织HE染色Fig 2 HE staining of renal tissue

肾小管损间质伤程度评分:IRI后72 h，EPC组的HSK评分为2.0±0.1，低于 IRI组(3.0±0.2)(H=95.386，P ＜0.01)，高于假手术组(0.5±0.2)(H=26.074，P ＜0.01)。

2.4 EPC对IRI后肾小管上皮细胞凋亡的影响

肾IRI后72 h，IRI组可见明显的肾小管上皮细胞凋亡(TUNEL阳性)，凋亡细胞主要集中在皮髓交界和外髓质，肾小球内凋亡细胞较少。IRI组细胞凋亡指数(29.7±6.7)较IRI组(66±10.5)显著降低(P＜0.01)，而假手术组几乎未见凋亡细胞(图3、4)。

图3 肾组织凋亡细胞染色Fig 3 Staining of renal tubular epithelial cell apoptosis

2.5 EPC对IRI后VEGF蛋白表达的影响

与假手术组相比，再灌注后72 h EPC组和IRI组VEGF蛋白表达升高，但EPC组表达量显著高于IRI组，差异有统计学意义(P＜0.05)(图4、5)。

图4 各组大鼠VEGF蛋白表达的比较Fig 4 The effect of EPC transplantation on VEGF by Western blotting analysis

图5 各组大鼠VEGF蛋白表达的比较Fig 5 The effect of EPC transplantation on VEGF by Western blotting analysis

3 讨 论

EPC作为一种定向分化为内皮细胞的骨髓源性干细胞，可对多种器官缺血性损伤产生修复作用［2-3，9］，逐渐引起了人们的重视。创伤、缺血、缺氧等因素均可刺激骨髓中EPC向外周血迁移、动员，对损伤的血管内皮产生修复作用［10］。但自身动员的EPC数量较少，不足以修复受损组织［11］，因此，EPC的体外扩增和移植为EPC研究的重要手段。

本实验通过体外分离、诱导、纯化、培养EPC并进行外源性移植入肾IRI大鼠，在移植后的24和48 h，EPC组大鼠肾功能相关指标虽高于假手术组，但其损伤程度较IRI组有明显改善，提示EPC移植在肾IRI早期即可发挥保护作用。EPC移植后72 h，移植大鼠肾组织内可见CM-Dil阳性EPC，主要位于肾脏皮髓交界处，而假手术组和IRI组未见CM-Dil阳性细胞，说明EPC能感知肾组织损伤而向损伤部位归巢，对血管内皮产生修复作用，保护受损肾脏。同时，EPC组的HSK评分及病理损伤程度显著低于IRI组，表明移植的EPC可能会启动内源性再生，促进肾小管上皮细胞自身的增殖、分化从而发挥修复作用［12-13］。

本实验还发现，在肾IRI后72 h，损伤肾组织不但存在肾小管空泡变性和细胞坏死脱落，还存在大量的凋亡细胞。凋亡是细胞死亡的特殊类型，与细胞坏死比较，凋亡(尤其是病变的早期)更容易通过药理学途径的干预得到逆转。本实验结果显示，IRI组大鼠的肾小管上皮细胞核TUNEL阳性比例较高，给予EPC移植后，凋亡指数明显降低，提示EPC移植有助于减轻IRI大鼠肾小管上皮细胞的凋亡，阻止肾损害的进展。

细胞凋亡受多种因素的调控，而VEGF是被公认的内皮细胞和上皮细胞凋亡的抑制剂［14］。本实验结果提示，EPC组VEGF含量显著高于IRI组及假手术组，移植的EPC可能通过自分泌/旁分泌作用分泌VEGF等细胞因子，对抗凋亡，这可能是对抗肾小管上皮细胞凋亡的重要因素，但确切的机制尚需进一步探讨。

［1］SCHRIER R W，WANG W，POOLE B，et al.Acute renal failure:definitions，diagnosis，pathogenesis，and therapy［J］.J Clin Invest，2004，114(1):5-14.

［2］范国峰，冯毅，童嘉毅.超声联合微泡对内皮祖细胞体外增殖、凋亡及细胞周期的影响［J］.东南大学学报:医学版，2009，28(2):109-112.

［3］赵红杰，刘玲，杨毅.骨髓间充质干细胞/内皮祖细胞治疗急性肺损伤的研究进展［J］.东南大学学报:医学版，2011，30(3):530-532.

［4］张铁须，周建中.内皮祖细胞与高血压病［J］.现代医学，2008，36(2):141-143.

［5］PATSCHAN D，KRUPINCZA K，PATSCHAN S，et al.Dynamics of mobilization and homing of endothelial progenitor cells after acute renal ischemia:modulation by ischemic preconditioning［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2006，291(1):F176-185.

［6］YANG N，LI D，JIAO P，et al.The characteristics of endothelial progenitor cells derived from mononuclear cells of rat bone marrow in different culture conditions［J］.Cytotechnology，2011，63(3):217-226.

［7］曹朴，薛建新，贾瑞鹏，等.内皮祖细胞对大鼠睾丸扭转复位后生精功能的影响［J］.中华医学杂志，2011，91(30):2135-2138.

［8］EDALATMANESH M A，BAHRAMI A R，HOSSEINI E，et al.Neuroprotective effects of mesenchymal stem cell transplantation in animal model of cerebellar degeneration［J］.Neurol Res，2011，33(9):913-920.

［9］LIU F，LIU Z D，WU N，et al.Transplanted endothelial progenitor cells ameliorate carbon tetrachloride-induced liver cirrhosis in rats［J］.Liver Transpl，2009，15(9):1092-1100.

［10］HOHENSTEIN B，KUO M C，ADDABBO F，et al.Enhanced progenitor cell recruitment and endothelial repair after selective endothelial injury of the mouse kidney［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2010，298(6):F1504-1514.

［11］di MARCO G S，RUSTEMEYER P，BRAND M，et al.Circulating endothelial progenitor cells in kidney transplant patients［J］.PLoS One，2011，6(9):e24046.

［12］BASILE D P.Challenges of targeting vascular stability in acute kidney injury［J］.Kidney Int，2008，74(3):257-258.

［13］BECHERUCCI F，MAZZINGHI B，RONCONI E，et al.The role of endothelial progenitor cells in acute kidney injury［J］.Blood Purif，2009，27(3):261-270.

［14］GALANI V，TATSAKI E，BAI M，et al.The role of apoptosis in the pathophysiology of Acute Respiratory Distress Syndrome(ARDS):an up-to-date cell-specific review［J］.Pathol Res Pract，2010，206(3):145-150.