抗艾滋病药物F18和尼非韦罗在Solutol HS15形成复合制剂后的高效液相色谱测定

刘超，袁钟平，吴稚伟

(南京大学医学院公共健康医学研究中心，江苏南京 210093)

F18［1］是calanolide A(吡喃型香豆素类化合物)的含氯衍生物，作为一种新型的艾滋病毒非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTIs)，正处于相关临床研究中;尼非韦罗［2］为合成的小分子 CCR5(人CC趋化因子受体5)拮抗剂，具有良好的抑制HIV-1感染的效果，其已经作为杀微生物剂［3］在中国完成了临床前研究，申请进行人体临床试验，二者的结构式见图1。通过两个或者两个以上药物混合起来的杀微生物剂被认为将有效提高阻断HIV-1性传播的效率，从而降低传播率［4］。尼非韦罗是有效的CCR5侵入抑制剂，而F18能高效抑制病毒的逆转录，二者有望在抗感染上形成良好的互补，配伍为复合杀微生物剂，但是二者都具有水溶性差的特点(溶解度都小于100 μg·ml-1)。本研究观察增溶剂Solutol HS15［7］同时溶解F18和尼非韦罗的效率，同时探索液相色谱条件［5-6］使之能够有效地区分这两种化合物，为后续的研究奠定基础。

图1 F18和尼非韦罗的化学结构式Fig 1 Molecular structure of F18 and nifeviroc

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

SHIMADZU LC-20AT高效液相色谱仪;岛津LCsolution色谱工作站GL Science Inertsil ODS column(4.60 mm ×250 mm，5 μm);BT124S 电子天平(德国赛多利斯);pHSJ-4A型pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司)。尼非韦罗对照品(上海靶点药物有限公司，批次200910，纯度＞98%)，F18(中国医学科学院药物研究所提供，20091009，纯度 ＞98%)，Solutol HS15(巴斯夫中国有限公司提供)，甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

1.2 色谱条件

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(4.60 mm×250 mm，5 μm)，采用甲醇(A 相)-复方醋酸缓冲液(B相，pH 4.5)为洗脱系统流动相。复方醋酸缓冲液配制方法:称取醋酸铵2.3 g，加水500 ml溶解并用醋酸调节pH至4.5，然后称取樟脑磺酸2.3 g，加水至1 000 ml。A 相和 B 相比例为65 ∶35，流速为1 ml·min-1，检测波长为265 nm，柱温为30℃，进样量为20 μl。相邻两峰的分离度不小于1.5。

1.3 对照品溶液的制备

精密称取F18 10 mg、尼非韦罗10 mg，将混合物加入10 ml容量瓶中，用甲醇定容制成1 mg·ml-1的溶液，作对照品线性贮备液。稀释对照品贮备液，得20、60、100、140、180 μg·ml-1系列浓度对照品溶液。

1.4 供试品溶液的制备

精密称取F18 10 mg、尼非韦罗10 mg，同时置于2 ml Solutol HS15中至完全溶解，将混合物加入10 ml容量瓶中，用甲醇定容制成1 mg·ml-1的溶液，作供试品线性贮备液。稀释供试品贮备液，得20、60、100、140、180 μg·ml-1系列浓度供试品溶液。

1.5 阴性对照液的制备

取2 ml Solutol HS15，用甲醇定容至10 ml容量瓶中。

1.6 检测波长的选定

采用紫外分光光度计测定两种药物的吸光度，从250～280 nm进行测定，1 nm为间隔，出现了一个抛物线状的吸收峰，取二者峰值最大处265 nm为HPLC检测条件。

2 结 果

2.1 专属性试验

分别精密吸取进样溶液各20 μl注入液相色谱仪，在选定的色谱条件下进样测定，结果见图2。由图2可见，F18和尼非韦罗在Solutol HS 15(HS15)中的测定无干扰，且能完全区分两种物质。

图2 化合物的高效液相色谱结果Fig 2 HPLC results of F18 and nifeviroc in Solutol HS15

2.2 线性范围

稀释对照品贮备液，得 20、60、100、140、180 μg·ml-1系列浓度对照品溶液，在选定的色谱条件下分别进样20 μl，记录各色谱峰面积，以峰面积为纵坐标、进样量为横坐标进行线性回归，各化合物的回归方程及相关系数见表1，两种化合物的线性范围均为20～180 μg·ml-1。

表1 回归方程和相关系数Tab 1 Regression equation and correlation coefficient

2.3 样品检出限试验

取上述1 mg·ml-1的样品溶液，分别稀释 10、100、1 000 倍，样品稀释至 100、10、1 μg·ml-1，仍然非常稳定，说明样品的含量极少时仍然能够被灵敏地检测出。

2.4 精密度和稳定性

取1 mg·ml-1供试品，连续进样6次，其 RSD为0.943 808%(RSD＜5%)，表明本方法精密度良好。取上述供试品溶液，进行稳定性考察，分别于0、2、4、8、12、24、48、72 h 进样20 μl测定，其 RSD 为1.091 056%，结果表明供试品溶液室温放置24 h稳定。取同一混合对照品溶液3组，分别在24、48、72 h按前述色谱条件进样测定，计算方法的精密度，结果为RSDF18=0.99%，RSD尼非韦罗=1.07%，表明本法的精密度良好。

2.5 加样回收率试验

精密称取F18和尼非韦罗各8、10、12 mg，每组3份，加入 10 ml容量瓶中，制备浓度为 0.8、1.0、1.2 mg·ml-1的溶液各3份，按上述色谱条件测定低、中、高3个加样水平平均回收率，结果显示F18 3个加样水平的平均回收率分别为102.5%(RSD=1.32%)、101.6%(RSD=1.43%)和 98.8%(RSD=1.51%)，加样平均回收率为100.5%(RSD=2.32%，n=9);尼非韦罗3个加样水平分别为101.4%(RSD=1.17%)、100.2%(RSD=1.35%)和 99.8%(RSD=1.51%)，加样平均回收率为100.4%(RSD=1.52%，n=9)。

3 讨 论

Solutol HS 15是一种现代高效能、极低毒性的增溶剂，溶血作用低;生理耐受性较高;可用蒸汽灭菌法，无需昂贵的无菌制造工艺;由于其溶解两种药物都能达到10 mg·ml-1以上的溶解度，而且溶解后和中性磷酸缓冲液混合后呈澄清状态，无明显的药物析出迹象，符合阴道内环境使用，因此适合应用在杀微生物剂研究领域。本研究将其作为F18和尼非韦罗的溶剂的结果显示，Solutol HS 15能够很好地溶解F18和尼非韦罗。本研究选用的是缓冲盐洗脱体系，选用的增溶剂和流动相的高效液相检测结果精密度、稳定性、线性关系良好，药物在溶剂中能够长时间地储存而且没有明显的分解，液相条件二者的峰值区分度良好。本研究所建立的分析检测条件具有较好的线性动态范围，良好的重复性和灵敏度，能够为后续的研究提供有效的检测和分析手段，为以后的阴道杀微生物剂及联合用药奠定了基础。本研究仅仅局限于色谱条件的摸索，缺乏相应的病毒学数据，在以后的研究中将会利用本研究成果进一步进行细胞学和动物学的相关实验。

［1］LU X，LIU L，ZHANG X，et al.F18，a novel small-molecule nonnucleoside reverse transcriptase inhibitor，inhibits HIV-1 replication using distinct binding motifs as demonstrated by resistance selection and docking analysis［J］.Antimicrob Agents Chemother，2012，56(1):341-351.

［2］XIE W D，CHENG Z.Determination of nifeviroc，a novel CCR5 antagonist:application to a pharmacokinetic study［J］.J Pharm Biomed Anal，2011，56(3):637-640.

［3］PADIAN N S，McCOY S I，ABDOOL-KARZW S S，et al.HIV prevention transformed:the new prevention research agenda［J］.Lancet，2011，378(9787):269-278.

［4］LIU S，LU H，NEURATH A R，et al.Combination of candidate microbicides cellulose acetate 1，2-benzenedicarboxylate and UC781 has synergistic and complementary effects against human immunodeficiency virus type 1 infection［J］.Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2005，49(5):1830-1836.

［5］倪冲，缪玉山，陈国明.高效液相色谱法测定曲尼司特滴眼液中曲尼司特及其有关物质的含量［J］.东南大学学报:医学版，2008，27(5):365-367.

［6］吴佳聪，彭丹红，任慕兰.阴道微生态的研究进展［J］.东南大学学报:医学版，2010，29(6):702-706.