21 - 清咽滴丸抗柯萨奇病毒CVB3 ，CVB5 作用的研究*

王小龙，陈 霞，迟 玮，褚玉晶，李志媛，李晓眠

(天津医科大学微生物学教研室，天津 300070)

清咽滴丸为新型主治咽炎中药合剂，具有疏风清热，解毒利咽，消肿止痛的功效［1］，临床效果显著。现代药理学研究表明，清咽滴丸有很强的抑菌杀菌作用，尤其是对白色念球菌和金黄色葡萄球菌［2］。柯萨奇病毒B3、B5(Coxsackie virus B3，B5;CVB3，CVB5)已证明是小儿病毒性心肌炎、无菌性脑炎、新生儿全身感染、流行性胸痛等疾病的主要病原体，目前尚无特效药治疗或预防。本试验对清咽滴丸及其六种成分抗柯萨奇病毒作用进行了初步试验研究，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物 清咽滴丸(天津市中新药业集团股份有限公司第六中药厂提供);甘草、青黛、冰片、诃子、牛黄、薄荷(天津市中新药业集团股份有限公司第六中药厂提供);病毒灵(山西太原药业有限公司生产)。

1.1.2 细胞与病毒株 Vero 细胞株;柯萨奇B3病毒Nancy 株;柯萨奇B5病毒Kauchker 株(天津医科大学微生物教研室提供)。

1.1.3 实验动物 雄性健康SD 大鼠18 只，体重均约250 g，购自中国医学科学院放射医学研究所医学实验动物中心。

1.1.4 试剂与耗材 RPMI-1640 培养基(Gibco);胎牛血清(Hyclone);四甲基偶氮唑蓝(MTT)(Sigma);二甲基亚砜(天津大学科威公司);96 孔培养板(Costar)。

1.1.5 仪器与设备 CO2培养箱(美国Thermo Forma，3111 型);倒置显微镜(德国Zeiss，Axiorert 200);酶标仪(Multiskan Mk3，Thermo Labsystems)。

1.2 方法

1.2.1 药物溶解与稀释 0.8 g 甘草、青黛、诃子、牛黄、病毒灵分别溶解于3.5 ml 1640 培养液后加入0.5 ml DMSO;0.8 g 冰片、薄荷分别溶解于0.5 ml DMSO后加入3.5 ml 1640 培养液。充分溶解后，1 500 r/min离心5 min，弃不溶残渣，高压灭菌。将无菌的药液先稀释10 倍后再做连续2 倍的递次稀释，配制药液浓度为:2. 0 ×10-2、1. 0 ×10-2、5 ×10-3、2. 5 × 10-3、1.25 ×10-3、6.25 ×10-4、3.125 ×10-4和1.56 ×10-4g/ml。

1.2.2 药物毒性实验 将Vero 细胞接种于96 孔板，100 μl /孔。分别加入上述各种浓度药物的稀释液，每个浓度4 复孔。另设正常细胞对照组、空白对照组。每日记录CPE［3］，72 h 后用MTT 法检测细胞存活率。细胞存活率(%)=(实验组平均OD 值-空白对照组平均OD 值)/(正常细胞对照组平均OD 值-空白对照组平均OD 值)×100%。

1.2.3 病毒滴度TCID50的测定 将Vero 细胞接种于96 孔板，将柯萨奇B3、B5病毒连续10 倍的递次稀释，稀释度为10-1～10-10。每孔接种10 μl 上述系列稀释度的病毒液，于37 ℃吸附2 h 后换维持液继续培养，每个浓度4 复孔。每日观察CPE，待细胞病变不再继续，按Reed-Muench 方法计算CVB3、CVB5的50%组织感染剂量(TCID50)。

1.2.4 药物对病毒的作用 配制药物无毒临界浓度TC0，加入病毒侵染的细胞中，每药物4 复孔。观察CPE，待病毒对照孔细胞病变达75%以上，记录各孔的CPE，MTT 法测病毒抑制率。病毒抑制率=(实验组平均OD 值-病毒对照组平均OD 值)/(正常细胞组平均OD 值-病毒对照组平均OD 值)×100%。

1.2.5 不同浓度含药血清对细胞毒性作用 取9 只大鼠随机分成3 组，每组3 只。将清咽滴丸、甘草、诃子按100 mg/kg 体重的药量给SD 大鼠灌胃(相当于成人临床推荐剂量的6 倍)［4］，给药前禁食12 h。给药后1 h 内眦取血，1 500 r/min 离心20 min，无菌分离血清，56 ℃水浴30 min 灭活［5］。将9 组含药血清稀释1∶ 2、1∶ 4、1∶ 6、1∶ 10、1∶ 16，100 μl/孔加到Vero 细胞中，每浓度4 复孔。每日观察细胞的生长情况，48 h后用MTT 法测细胞存活情况。

1.2.6 不同时间含药血清对病毒的抑制作用 取9只大鼠随机分成3 组，每组3 只。将清咽滴丸、甘草、诃子按100 mg/kg 体重的药量给SD 大鼠灌胃(相当于成人临床推荐剂量的6 倍)，给药前禁食12 h。灌胃前第1 次内眦取血，灌胃25 min 之后，第2 次取血，以后每隔20 min 取血1 次，每次取血约1.5 ml。总共采血6 次。无菌分离血清之后，将9 组血清按100 μl/孔加入到被病毒感染的单层Vero 细胞中，每组设4 复孔，每日记录CPE。48 h 后用MTT 法测细胞存活情况。

1.2.7 统计学处理 采用统计软件SPSS 11.5 对数据进行ANOVA 单因素方差分析，各组间两两比较采用Dunnett 检验。

2 结果

2.1 清咽滴丸及其六种成分对细胞毒性作用 薄荷对细胞的毒性表现在使细胞先变细长呈梭形，继而变小变圆。清咽滴丸、甘草、青黛、诃子、牛黄、冰片、病毒灵直接使细胞变小变圆。高浓度时细胞固缩破碎死亡量增大明显。各药物无毒临界浓度(TC0):甘草为2.5 ×10-3g/ml，青黛为3. 125 × 10-4g/ml，冰片为2.5 ×10-3g/ml，牛黄为1. 56 × 10-4g/ml，诃子为3.125 ×10-4g/ml，薄荷为6.25 ×10-4g/ml，病毒灵为6.25 ×10-4g/ml。

2.2病毒滴度CVB3:TCID50= 10-7.6，CVB5:TCID50=10-7.2

2.3 药物对病毒的作用 病毒对照组CPE 现象明显，清咽滴丸、甘草、诃子组细胞病变明显减弱，说明清咽滴丸、甘草、诃子对CVB3、CVB5感染的细胞有治疗作用。其他组CPE 达75%以上，说明其他药物无效。在CVB3感染的细胞实验中，清咽滴丸组与病毒灵对照组差别有统计学意义(P ＜0.05)，甘草组与病毒灵对照组差别有统计学意义(P ＜0.05)，说明清咽滴丸、甘草对CVB3感染的细胞治疗效果优于病毒灵。诃子组与病毒灵对照组差别无统计学意义(P ＞0.05)，说明诃子对CVB3感染的细胞治疗效果不优于病毒灵。在CVB5感染的细胞实验中，清咽滴丸组、甘草组、诃子组与病毒灵对照组差别均有统计学意义(P ＜0.05)，说明清咽滴丸、甘草、诃子对CVB5感染的细胞治疗效果优于病毒灵。见表1。

表1 不同药物对CVB3 和CVB5 的OD 值和抑制率

2.4 不同浓度含药血清对细胞毒性作用 稀释度为1∶ 10含清咽滴丸血清组、1∶ 10含甘草血清组、1 ∶ 6含诃子血清组均与病毒对照组CPE 有明显差别，表现为对细胞的保护作用，且此时血清的毒性作用小。

2.5 不同时间含药血清对病毒的抑制作用 将含药血清分别对CVB3和CVB5的抑制率绘制成时间-效应曲线，提示含药血清对CVB3、CVB5的抑制作用具有明显的时间依赖性，即清咽滴丸在65 min 时对CVB3，在65 min 至105 min 对CVB5有明显抑制作用。而甘草在65 min 时，诃子在85 min 时分别对CVB3有明显抑制作用。甘草在65 min，诃子在85min 时对CVB5有抑制作用但效果并不明显见图1 -3。

图1 不同时刻含清咽滴丸血清对CVB3 和CVB5 的抑制率

图2 不同时刻含甘草血清对CVB3 和CVB5 的抑制率

图3 不同时刻含诃子血清对CVB3 和CVB5 的抑制率

3 讨论

柯萨奇病毒B3、B5是正链RNA 病毒，主要通过粪-口途径传播，也可通过呼吸道或眼部黏膜感染。研究发现，约50%病毒性心肌炎系CVB3所致［6］。CVB5可以引起病毒性肝炎，持续感染可诱发肝硬化、肝癌。药理学研究表明，清咽滴丸具有抗菌的作用。实验证实甘草具有肾上腺皮质激素作用，可抗病毒、消炎、抗变态反应。抗病毒的主要活性成分为甘草甜素和甘草多糖，既可直接清除病毒颗粒，又可诱生干扰素，增加自然杀伤细胞活性，从而使组织细胞得到保护。诃子果实水煎液有杀菌效用［7］。

在实验研究中，采用了血清药理学方法［8］，因为中药粗制剂含有大量的杂质，如直接应用它进行体外实验，这些杂质会干扰实验过程，影响实验结果的科学性。因此，目前中药药理学研究中，有相当一部分中药药理活性实验和作用机理研究是用血清药理学进行的。同时，也应该看到，血清药理学作为一种年轻的实验研究方法还不够完善，存在着许多尚待解决的问题，如目前由于血清中有效成分的定量分析检测尚未有突破性进展，因此还没有关于不同状态血清中有效成分的药代动力学的研究比较。

本实验提示了甘草和诃子是清咽滴丸抗CVB3、CVB5的有效成分，为甘草和诃子作为抗病毒感染药物进行进一步开发研究提供了科学的理论依据，但甘草和诃子抗病毒的机制不明，有待更加深入的研究，其成分还需通过化学分析进一步明确其单体构成，其抗CVB3、CVB5的作用还需要在动物体内试验上进一步加以证实。

1 詹可顺，魏伟，余南生.清咽滴丸治疗慢性咽炎的临床研究.中国基层医药，2003，10(11):1129

2 齐伟，郭长源.中药清咽滴丸的研制和疗效观察. 华夏医药，2006，1(2):110

3 王亚峰，张美英，郝静，等.苦丁茶水提物体外抗柯萨奇病毒B3活性的实验研究.中华中医药杂志，2008，23(11):976

4 章元沛. 药理学实验. 第2 版. 北京:人民卫生出版社，1996:238 -238

5 刘成海，刘平，刘成，等.抗肝纤维化有效中药复方血清药理学方法探讨.中国实验方剂学杂志，1998，4(2):16

6 Selinka H C，Wolde A，Sauter M，et al. Virus - receptor interactions of coxsackie B viruses and their putative influence on cardiotropism. Med Microbiol Immunol，2004，193(2 -3):127

7 蔡小华，谢兵，杜海军.诃子化学成分及药理作用的研究进展.药学进展，2008，32(5):212

8 崔晓兰，贺玉琢，高英杰，等.中药复方血清药理研究方法学探讨. 中国实验方剂学，1998，4(2):13