ERK5 在结直肠癌组织中的表达及其与结直肠癌转移的关系*

胡 邦， 谢尚奎， 黄美近， 蒋 李， 彭 慧， 汪建平， 任东林△， 王 磊△

(1 中山大学附属第六医院胃肠病研究所，广东 广州510655;2深圳市人民医院普外科，广东 深圳518035)

结直肠癌是消化系统常见的恶性肿瘤，近年来其发病率快速增长，严重危害人类的健康。在全世界范围内，结直肠癌已经成为男性的第三大恶性肿瘤和女性的第二大恶性肿瘤，2008 年全球新增120万结直肠癌患者，死于结直肠癌的人数约为608 700人次［1］。在我国，结直肠癌的发病率也已经跃居为男性恶性肿瘤的第4 位和女性恶性肿瘤的第3位［2］。结直肠癌的预后和肿瘤远处转移密切相关，发生远处转移结直肠癌患者的总体5 年生存率仅为12%左右，但早期结直肠癌的5 年生存率可达到90%［3］。目前临床上对远处转移的诊断方法主要包括:影像学检查(CT、MRI 或PET -CT)、腹部超声、术中的直接触诊和视诊。但是这些传统的检查方法最大的缺陷是很难发现微小的转移灶，如直径1 cm以下的肝转移灶［4］。因此，寻找到一种能够早期诊断远处转移的标记物对转移性结直肠癌的综合治疗是非常重要的。

丝裂原活化蛋白激酶(mitogen -activated protein kinase，MAPK)家族是一类高度保守的苏氨酸/酪氨酸蛋白激酶，可通过严格的3 级酶促级联反应(MAPKKK→MAPKK→MAPK)激活，进而调节特定基因的表达。细胞外信号调节激酶5(extracellular signal - regulated kinase 5，ERK5)是最新发现的MAPKs 家族中的一个重要的一级激酶，它通过Thr218/Tyr220 双位点的磷酸化激活后进一步激活下游的癌基因如:MEF2、c－fos、Fra－1、Sap－1、c－myc 和NF－κB［5］。近期研究发现，ERK5 通过促进血管的形成和血管内环境的稳定对维持肿瘤的生长起重要作用［6-7］。ERK5 在前列腺癌［8］、乳腺癌［9］、口腔鳞状细胞癌［10］、Hodgkin 淋巴瘤［11］以及恶性间皮瘤［12］中过度表达。但ERK5 在结直肠癌中的表达情况却没有报道。本研究通过免疫组化检测ERK5蛋白在结直肠癌组织中的表达情况，并分析其与结直肠癌临床病理参数及预后的相关性，初步探讨其在结直肠癌发生发展中的作用。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 病例资料 随机收集中山大学附属第一医院2000 ～2006 年结直肠病例组织石蜡标本338 例，其中结直肠腺癌组织338 例、癌旁正常组织80 例(距离肿瘤边缘5 cm 以上)。所有肿瘤组织标本和癌旁正常黏膜组织通过HE 染色被证实。338 例肿瘤患者中，男性179 例，女性159 例;年龄19 ～91 岁，平均年龄59.07 岁。338 例结直肠癌病例中I 期病例46例，II 期病例145 例，III 期病例120 例，IV 期病例27例(按照2009 年国际抗癌联盟制定的第7 版TNM分期标准)。所有患者均未接受过术前放化疗，临床病理及随访资料包括性别、年龄、体重指数(dody mass index，BMI)、肿瘤位置、分化程度、TNM 分期［根据肿瘤(tumor，T)、淋巴结(nodes，N)和转移(metastasis，M)情况的分类法］、以及5 年总的生存率情况。338 例患者中有27 例失访，病人的临床病理资料已发表［13］。

1.2 主要仪器及试剂 ALPHELYS 组织芯片制作仪;LeiCaRM2245 型切片机;兔抗人ERK5 多克隆抗体(sc-5626，Santa Cruz);HRP -Peroxide -DAB 试剂盒(DACO)。

2 方法

2.1 制作组织芯片 组织芯片的制作方法在我们早先的文献已介绍［14］。简而言之，首先选择所需结直肠癌病理存档蜡块，根据HE 切片进行形态学观察，确定具有代表性的病变部位并标记。每个标本取2 个点，直径1 mm，按照组织芯片制作仪操作流程，制成组织芯片蜡块，每个芯片蜡块含12 ×8 个点。将芯片蜡块切片，厚度4 μm，裱于载玻片上。

2.2 免疫组织化学染色 采用SABC 免疫组织化学法染色，组织芯片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，3%H2O2中消除内源性过氧化物酶活性，pH 6.0 的柠檬酸钠溶液中微波抗原修复。滴加适量ERK5 抗体(浓度1∶200)4 ℃过夜，按DACO 试剂盒说明进行染色，DAB 显色和苏木素复染，用已知阳性片作阳性对照，以PBS 代替Ⅰ抗作为阴性对照。

2.3 结果判读 ERK5 染色的评分由2 个独立和有经验的病理科医生判读。阳性表达为细胞浆染色，主要表现为胞浆内非均匀棕黄色颗粒。结果判读采用半定量积分分级，积分=染色强度×染色细胞比例。染色强度:0 分为阴性(无色)，1 分为浅灰色，2 分为淡黄色，3 分为黄色，4 分为棕黄色;染色细胞比例:0 分为无阳性细胞，1 分为1%～25%，2 分为26% ～50%，3 分为51% ～75%，4 分为76% ～100%［15］。两者相乘为总的分数，0 ～11 分纳入低表达组，12 ～16 分被纳入到高表达组。

3 统计学处理

使用SPSS 16.0 软件进行分析。采用χ2检验分析ERK5 在正常黏膜组织和癌组织中的表达差异以及ERK5 表达水平和各项临床参数的相关性。通过Kaplan-Meier 生存分析ERK5 的表达水平及各个临床参数与预后的关系;然后通过Cox 回归分析肿瘤预后相关的独立危险因子。

结 果

1 ERK5 在正常黏膜和结直肠腺癌中的表达

ERK5 在正常黏膜和癌组织中表达均位于胞浆，未见明显胞核染色，见图1。根据评分标准，分为高表达(≥12 分)和低表达(＜12 分)两组。80 例正常黏膜标本中，59 例(73.8%)低表达，21 例(26.2%)高表达;338 例结直肠癌标本中，204 例(60.4%)为低表达，134 例(39.6%)高表达。统计学分析发现:2 组ERK5 蛋白表达水平有显著差异，ERK5 在结直肠癌组织中的表达明显高于癌旁正常黏膜组织(P ＜0.05)，见表1、图1D1、2。

Figure 1. Immunohistochemical analysis of the expression of ERK5 protein (upper panels，×100;lower panels，×400).ERK5 expression was localized within the cytoplasm. A1 and A2:only weak staining of ERK5 was detected in normal colorectal epithelial tissue;B1 and B2:moderately positive expression of ERK5 in CRC without distant metastasis;C1 and C2:strongly positive expression of ERK5 in CRC with distant metastasis;D1 and D2:elevated ERK5 expression in the tumor cells of CRC tissue compared with those of adjacent normal mucosa.图1 免疫组织化学法检测ERK5 在结直肠癌腺体及正常腺体中的表达

表1 ERK5 在正常结直肠粘膜和结直肠癌组织中的表达Table 1. ERK5 expression in normal mucosa and CRC tissues

2 ERK5 表达与结直肠癌临床病理参数的相关性分析

通过χ2检验分析ERK5 的表达和临床参数的关系发现，ERK5 高表达与结直肠癌远处转移(P ＜0.05)呈正相关。然而，肿瘤组织中ERK5 表达量与性别、年龄、BMI、肿瘤位置、T 分期、N 分期、TNM 分期和分化程度无明显相关(P ＞0.05)，见表2。

在转移结直肠癌标本中ERK5 的表达强度明显增高，27 例发生远处转移的结直肠癌标本中，17 例(63.0%)标本中高表达ERK5 蛋白(见图1 C1、2);相反的，在311 例未发生远处转移的结直肠癌标本中，仅仅117 例(37. 6%)标本高表达ERK5 蛋白。这表明:与未发生远处转移患者相比，发生远处转移患者的癌组织中的ERK5 蛋白表达水平更高。

3 生存分析

病人的平均随访时间61.06 个月，中位随访时间62.00 个月。311 例原发性结直肠癌患者总的5年生存率为68.5%，98 例患者死亡。我们通过单因素的log -rank 检验显示，结肠癌和直肠癌肿瘤组织中高表达ERK5 的患者总体5 年生存率和低表达组无明显差异(P ＞0.05)，见图2A。但是，通过进一步的分层分析，在直肠癌中肿瘤组织中高表达ERK5的患者总体5 年生存率明显低于低表达组(P ＜0.05)，见图2B。表3 显示与结直肠癌预后相关的临床参数包括肿瘤位置(P ＜0.01)、淋巴结转移(P＜0.01)、远处转移(P ＜0.01)以及TNM 分期(P ＜0.01)。

单因素生存分析有意义的指标被纳入多因素生存分析;但是，TNM 分期与T 分期、淋巴结转移以及远处转移是一致的，所以我们将TNM 分期从最终的模型里剔除［16］。多因素Cox 生存分析结果显示:临床参数中远处淋巴结转移(P ＜0.05)、远处转移(P＜0.01)和肿瘤位置(P ＜0.01)是结直肠癌患者总体5 年生存率的独立危险因子，见表3。

讨 论

ERK5 蛋白被报道在多个肿瘤的转移过程中有重要作用，其通过调控黏着斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)信号促进整合素介导的细胞黏附和增强癌细胞活力;同时，ERK5 的激活可以促进Src 蛋白相关的浸润黏附因子形成进而限制Rho蛋白的活性［17］。在伴有远处骨转移的前列腺癌中，ERK5 蛋白的表达量明显升高，并通过促进基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase -9，MMP -9)的生成促进了前列腺癌的进展［18］;2008 年，Sticht 等［10］研究发现，高表达的磷酸化ERK5 和口腔鳞状细胞癌的进展以及淋巴结的转移密切相关;在乳腺癌细胞中，ERK5 信号通路通过MET 受体/乳腺肿瘤激酶信号(BRK)介导HGF 诱导的癌细胞迁移，在乳腺癌的远处转移过程中起重要作用［19］;这些研究提示ERK5蛋白可能和肿瘤的转移有关。

表2 ERK5 的表达情况与结直肠癌患者临床病理资料的关系Table 2. Correlation between ERK5 expression and clinicopathologic characteristics

我们通过免疫组化的方法检测338 例癌组织和80 例癌旁正常的黏膜组织中的ERK5 表达量，发现ERK5 在结直肠癌患者的癌组织中表达较癌旁正常组织中升高，这一结果和国内另一家研究单位报道的结果一致［20］。进一步分析ERK5 的表达情况和各个临床参数的关系显示:在远处转移的结直肠癌患者癌组织中，检测到ERK5 高表达的频率较没有远处转移患者的肿瘤组织标本中表达量高(P ＜0.05)。这表明ERK5 可能在肿瘤的转移过程中扮演了非常重要的角色，这一现象和之前报道的在前列腺癌、乳腺癌中的研究结果一致［18-19］。

Figure 2. Survival analysis of primary colorectal cancer patients (n=311). A:no correlation was found between colorectal cancer patient survival and the expression of ERK5 (P ＞0.05);B:for rectal cancer patients，ERK5 -high group showed worse survival than that in ERK5 -low group (P ＜0.05)P values were calculated using the log-rank test.图2 不同ERK5 表达水平的结直肠癌患者生存曲线的比较

表3 311 例结直肠癌患者总体5 年生存率的Kaplan－Meier 单因素及Cox 多因素分析Table 3. Kaplan-Meier univariate analysis and Cox proportional hazards model multivariate analysis of individual parameters for correlations with 5 -year overall survival

目前结直肠癌诊疗面临的最大的挑战之一是早期诊断结直肠癌的远处转移以及在此基础上进行的是否需行辅助治疗的判断［21］。对于早期的结直肠癌患者，仅仅需要外科手术治疗［22］;而对于进展期的患者，除了手术治疗外还需要化疗或者放疗的辅助性治疗提高患者生存期［23］。目前临床上，癌胚抗原CEA 被作为一个诊断和随访监测结直肠癌患者的重要指标。但是，CEA 并非结直肠癌所特有的标志物，它在良性肝脏疾病、炎症性肠病、胰腺炎、其它恶性肿瘤以及吸烟患者血液中也会升高［24］。国外一篇文献荟萃分析报道，CEA 监测结直肠癌患者术后转移及复发的敏感度为64%［25］。因此，我们需要找到一些特异性和敏感度好的标记物用于结直肠癌转移诊断及术后监测。我们的研究发现ERK5 在转移的结直肠癌中表达是明显升高，这个现象预示ERK5 的表达升高和结直肠癌转移密切相关。对于临床未发现远处转移，而肿瘤组织中ERK5 高表达的结直肠癌患者我们需要更为密切的关注以及更多的辅助检查是否存在远处转移。

我们通过Kaplan-Meier 生存分析发现，高表达ERK5 仅仅在直肠癌患者中与总体5 年生存率相关(P ＜0.05)。338 例结直肠癌患者临床预后资料的Cox 多因素生存分析提示淋巴结的转移、远处转移和肿瘤的位置是结直肠癌患者预后的独立影响因子。

综上所述，高表达的ERK5 和结直肠癌的远处转移密切相关，肿瘤组织中高表达ERK5 的结直肠癌患者可能需要更多的辅助性治疗和更为紧密的随访。但是，本研究中发生远处转移标本例数偏少，可能会带来统计学上的误差，ERK5 能否作为临床上治疗选择标记物及其促进结直肠癌转移的机制仍需要进一步的实验研究证实。

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