Notch通路与基质金属蛋白酶在软骨肉瘤中的表达及意义

高 峰 赵玉峰 王晓梅 杨建柱 王晓萌

Notch通路与基质金属蛋白酶在软骨肉瘤中的表达及意义

高 峰 赵玉峰 王晓梅 杨建柱 王晓萌＊

（河北医科大学第三医院病理科，石家庄050051）

目的 研究软骨肉瘤组织中Notch通路、p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）及基质金属蛋白酶（MMPs）的表达情况，探讨它们在软骨肉瘤间质浸润中的作用机制。方法 收集正常软骨组织标本10例、内生性软骨瘤标本23例和软骨肉瘤标本32例，分别用免疫组化、Western blot和real-ti me PCR检测 Notch1、Jagged1、MMP-1、MMP-13、p38 MAPK及p-p38 MAPK的表达情况。结果 与正常软骨组织相比，Notch1、Jagged1、MMP-1、MMP-13及p-p38 MAPK在内生性软骨瘤表达部分升高，在软骨肉瘤表达均明显增加（P＜0.01）。p38 MAPK在正常软骨组织、内生性软骨瘤及软骨肉瘤组织中表达无明显差异（P＞0.05）。结论Notch通路和p38 MAPK通过调节基质金属蛋白酶在软骨肉瘤中的表达，来增加软骨肉瘤的浸润转移能力。

软骨肉瘤；Notch通路；基质金属蛋白酶；P38丝裂原活化蛋白激酶

软骨肉瘤是常见的骨原发恶性肿瘤，多以局部或广泛的手术切除为主要治疗手段，但切除后复发及转移的几率较高，软骨肉瘤主要通过对细胞外基质（ECM）的降解发生侵袭和转移。最近研究发现，某些基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases，MMPs）家族成员参与了ECM的降解过程，其高表达与软骨肉瘤的浸润转移能力有关。Notch通路和p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）是重要的信号通路，与细胞的分化、增殖等有关，并参与多种物质的调节。本研究观察Notch通路、p38 MAPK及MMPs在软骨肉瘤中的表达情况，探讨三者之间的相互关系，为今后软骨肉瘤的治疗提供理论依据。

材料和方法

1.标本收集

收集河北医科大学第三医院2009年-2011年病理诊断软骨肉瘤标本32例，并收集同期正常软骨组织10例，内生性软骨瘤标本23例。收集患者的影像学资料及临床资料，留取新鲜手术病理组织标本超低温冰箱保存，并同时留取病理组织中性甲醛固定，进行组织脱水，石蜡包埋。

2.试剂

兔抗人Jagged1、MMP-1、MMP-13和p38 MAPK多克隆抗体（Santa Cruz公司）；兔抗人p-p38 MAPK多克隆抗体（Cell Signaling公司）；兔抗人Notch1多克隆抗体（Abcam公司）；鼠抗人β-actin单克隆抗体（北京中杉金桥公司）。

3.免疫组化检测Jagged1、Notch1、MMP-1和MMP-13的表达

石蜡切片脱蜡水化后，3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶，微波热处理修复抗原，正常小牛血清封闭非特异性抗原，分别加入一抗，4℃孵育过夜。加入生物素化二抗，室温下孵育30 min，滴加DAB显色液，常规脱水，封片。棕褐色为阳性着色。PBS代替一抗，做阴性对照。

4.Wester n blot检测 Jagged1、Notch1、p38 MAPK、p-p38 MAPK、MMP-1和 MMP-13的表达

用RIPA裂解液（含1×PBS，1%NP-40，0.5%去氧胆酸钠，0.1%SDS，用前加PMSF 0.1 g／L）提取软骨肉瘤组织总蛋白，用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，取100μg样品上样，8%SDS聚丙稀酰胺凝胶电泳。4℃、100 mA稳流转膜过夜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h。加入Jagged1、MMP-1、MMP-13、p38 MAPK（1∶200）及Notch1、p-p38 MAPK、β-actin（1∶1000稀释）一抗，4℃孵育过夜，洗膜后加适量辣根过氧化物酶标记IgG二抗，于37℃孵育2 h，将ECL试剂盒中的A液和B液等量混合，滴加于膜上，在暗室中显影，底片经扫描仪透扫后凝胶分析软件分析结果。以Jagged1、Notch1、MMP-1、MMP-13、p38 MAPK、p-p38 MAPK 与β-actin光密度的比值分别表示其相对表达量。

5.Real-ti me PCR 法检测Jagged1和 Notch1 mRNA的表达

应用RNA prep pure组织总RNA提取试剂盒提取总RNA。反转录反应体系总体积为20μl，按照反转录说明书合成c DNA。引物分别为：Jagged1，上游5’-AGA AGT CAG AGT TCA GAG GCG TCC-3’，下游5’-AGT AGA AGG CTG TCA CCA AGC CAA C-3’（112bp）；Notch1，上游5’-GTG GAT GAC CTA GGC AAG TCG-3’，下 游 5’-GTC TCC TCC TTG TTG TTC TGC A-3’（118bp）；18S，上游5’-CGC CGC TAG AGG TGA AAT TC-3’，下游5’-CCA GTC GGC ATC GTT TAT GG-3’（149bp），均由北京奥科公司合成。PCR反应体系总体积为50μl，扩增条件为94℃预变性2 min，94℃变性25 s，60℃退火30 s，40个循环结束。由PCR反应曲线得到Ct值，采用2-△△Ct法计算相对定量结果。

6.统计学处理

所有数据均用¯x±s表示：组间数据比较用t检验，数据统计应用SPSS统计软件完成。

结 果

1.免疫组化

Jagged1和Notch1在软骨细胞胞膜均呈阳性表达，软骨肉瘤表达强于内生性软骨瘤和正常软骨组织；MMP-1和 MMP-13在软骨细胞胞浆均呈阳性表达，软骨肉瘤表达强于内生性软骨瘤和正常软骨组织（图1）。

图1 免疫组化检测软骨肉瘤组织Notch1、Jagged1、MMP-1和 MMP-13的表达（×200）。Fig.1 Immunohistochemical staining of Notch1，Jagged1，MMP-1 and MMP-13 in chondrosarco ma（×200）.

2.Wester n印迹

Jagged1、Notch1、p-p38 MAPK、MMP-1和 MMP-13蛋白在正常软骨组织仅有少量表达，内生性软骨瘤中Jagged1、MMP-1和 MMP-13表达已有所增加，在软 骨 肉 瘤 组 织 Jagged1、Notch1、p-p38 MAPK、MMP-1和 MMP-13表达明显增强（P＜0.01）；p38 MAPK在正常软骨组织、内生性软骨瘤及软骨肉瘤组织中表达无明显差异（P＞0.05）（图2，表1）。

图 2 Wester n blot 检 测 Jagged1、Notch1、p-p38 MAPK、p38 MAPK、MMP-1和 MMP-13蛋白的表达。1：正常软骨组织；2：内生性软骨瘤；3：软骨肉瘤Fig.2 Wester n blot detected the protein levels of Jagged1，Notch1，p-p38 MAPK，p38 MAPK，MMP-1 and MMP-13.1：nor mal cartilage tissue；2：enchodr o ma；3：chondrosarco ma

3.Real-ti me PCR

与正常软骨组织比较，Jagged1和Notch1 mRNA在内生性软骨瘤表达增加；软骨肉瘤组织Jagged1和Notch1 mRNA表达较正常软骨组织和内生性软骨瘤明显增强（P＜0.01）（表2）。

表2 Real-ti me PCR检测Jagged1和Notch1 mRNA的表达（¯x±s）Table 2 Real-ti me PCR detected the mRNA levels of Jagged1 and Notch1（¯x±s）

表1 Western blot检测Jagged1、Notch1、p-p38 MAPK、p38 MAPK、MMP-1和MMP-13蛋白的表达（¯x±s）Table 1 Wester n blot detected t he pr otein levels of Jagged1，Notch1，p-p38 MAPK，p38 MAPK，MMP-1 and MMP-13（¯x±s）

讨 论

软骨肉瘤是常见的骨原发恶性肿瘤，占骨恶性肿瘤的14.24%。软骨肉瘤对放疗、化疗等辅助治疗手段不敏感，多以局部或广泛的手术切除为主要治疗手段，但切除后复发及转移的几率较高［1］。现已知侵袭和转移是恶性肿瘤的主要特征，主要是通过对ECM的降解，降解血管基底膜，侵入淋巴管和血管等机制而起作用，软骨肉瘤也通过此过程发生侵袭和转移［2］。基质金属蛋白酶（MMPs）家族在ECM的降解过程中发挥着重要的作用，MMPs是降解ECM最重要的一组蛋白酶，可降解ECM的所有成分［3］。大量研究表明，MMP-1和 MMP-13在多种恶性肿瘤中呈现过表达，在恶性肿瘤的浸润转移中 起 着 重 要 作 用［4］。本 研 究 发 现 MMP-1 和MMP-13蛋白水平在正常软骨组织中低表达，内生性软骨瘤表达升高，而在恶性的软骨肉瘤中表达明显升高。在软骨肉瘤组织中MMP-1和MMP-13通过其胶原酶活性，降解ECM，来增强其侵袭性。

Notch和p38 MAPK都是重要的信号传导通路。相邻细胞可以通过Notch受体与配体的结合传递Notch信号，最终决定胚胎发育、细胞分化和肿瘤发病［5］。最近研究发现，Notch通路在非小细胞肺癌中可上调 MMPs的表达［6］。研究还发现，p38 MAPK在乳腺癌、非小细胞肺癌、肝癌等多种恶性肿瘤中可上调 MMPs的表达，但Notch、p38 MAPK和MMPs在软骨肉瘤中的关系还不清楚［7，8］。我们发现，软骨肉瘤 MMP-1和 MMP-13高表达伴有Notch通路和p38 MAPK的激活。软骨肉瘤细胞MMPs表达增强可能是通过Notch和p38 MAPK通路来实现的。

通过探索MMPs及其其它信号通路在软骨肉瘤侵袭和转移过程中的作用机制，可为今后通过抑制相应信号通路对软骨性肿瘤治疗提供必要的理论依据。如果能够找到某个靶点来抑制软骨肉瘤细胞对ECM的降解，就能阻止软骨肉瘤的复发和转移，成为今后软骨肉瘤治疗的突破点。

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Expression and Significance of Notch pathway and Matrix Metalloproteinase in Chondrosarcoma

Gao Feng，Zhao Yufeng，Wang Xiao mei，Yang Jiangzhu，Wang Xiao meng＊
（Depart ment of Pathology，The Thir d Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050051，China）

Objective To study the expression and significance of Notch pathway，p38 mitogen-activated pr otein kinase（MAPK）and matrix metalloproteinases（MMPs）in chondr osarco ma.Met hods The expression of Notch1，Jagged1，MMP-1，MMP-13，p38 MARK and p38 MAPK were deter minated in speci mens of 10 cases of nor mal cartilage tissue，23 cases of enchodr o ma and 32 cases of chondr osarco ma by i mmunohistoche mistr y，Wester n blot and real-ti me PCR.Results The positive expression of Notch1，Jagged1，MMP-1，MMP-13 and p38 MAPK in chondrosarco ma was higher than that of nor mal cartilage tissue and enchodr o ma tissue（P＜0.01）.There was no diff erence in p38 MAPK expression bet ween nor mal cartilage，enchodro ma and chondrosarco ma tissues（P＞0.05）.Conclusion Notch pathway and p38 MAPK may mediate the up-regulation of MMPs，which can enhance the infitration and metastasis capability of chondr osarco ma.

Chondrosarco ma；Notch pathway；Matrix metalloproteinase；p38 mitogen-activated pr otein kinase

R738.3

A

10.3870／zgzzhx.2012.04.010

2012-02-10

2012-05-25

河北省医学科学研究重点课题计划（20100350）

高峰，男（1978年），汉族，主治医师。

＊通讯作者（To who m correspondence should be addressed）