PTSD大鼠中缝背核神经元T MP酶表达变化的实验研究

刘冬娟 肖 冰 徐 盟 韩 芳3＊ 石玉秀，3＊

PTSD大鼠中缝背核神经元T MP酶表达变化的实验研究

刘冬娟1肖 冰1徐 盟2韩 芳3＊1石玉秀1，3＊2

（1中国医科大学基础医学院电子显微学研究室；2中国医科大学九十五期七年制；3中国医科大学基础医学院组织胚胎学教研室，沈阳110001）

目的 研究创伤后应激障碍大鼠中缝背核神经元细胞T MP（三偏磷酸酶）活性分布及其表达变化。方法 采用SPS刺激方法，建立PTSD样大鼠SPS模型，随机分为SPS刺激后1d、7d、14d和正常对照组，应用光、电镜酶组化技术方法，分别对各组中缝背核神经元细胞T MP活性分布及其变化进行观察和定量检测。结果 光镜下T MP酶反应阳性产物为棕褐色颗粒分布于细胞质中；电镜下T MP酶反应阳性产物为高电子密度的黑色颗粒沉淀，分布于各组中缝背核神经元细胞内溶酶体上。SPS刺激后1d、7d、14d中缝背核神经元T MP活性表达比正常对照组明显增强，并于7d达到高峰。结论 创伤后应激障碍大鼠中缝背核神经元细胞T MP活性增强，提示T MP参与了中缝背核神经元细胞凋亡产物的降解和处理过程。

创伤后应激障碍；中缝背核；神经元；T MP

创伤后应激障碍（posttrau matic stress disorder，PTSD）是指对灾难、战争、恐怖事件、交通意外、虐待等严重应激因素的一种异常精神反应［1］，也是应激疾病中最为典型的一种［2］，出现创伤经历再体验、对有关创伤性情境的回避和情感麻木、警觉过度等症状［3］。其症状出现是因为中枢神经系统对应激信息的记忆过程出现了障碍，使条件化的恐惧难以抑制或过分抑制所致。中缝背核（dorsal raphe nucleus）位于脑桥上部向上至中脑动眼神经核尾侧部，在中央灰质的腹侧。中缝背核支配区较大［4］，其纤维投射十分广泛与各脑区有着复杂的神经纤维关系。有报道PTSD患者存在脑桥体积缩小及灰质密度减少［5］，PTSD促进大鼠中缝背核细胞色素C的释放，提示PTSD样大鼠中缝背核神经元可能存在细胞凋亡［6］，致中缝背核功能异常。三偏磷酸酶（Thina mine monophosphatase，T MP）是溶酶体的标志酶，也是溶酶体的蛋白水解酶［7］，T MP活性表达的变化可以表示溶酶体的功能状态。SPS（single prolonged stress）动物模型是目前探讨PTSD的发病机制比较理想的实验模型。通过观察应激条件下三偏磷酸酶（Thina mine monophosphatase，T MP）活性表达的变化，探讨PTSD样大鼠中缝背核神经元T MP活性变化与细胞凋亡的相关性，旨在为揭示PTSD的发病机理奠定生物学基础。

材料和方法

1.材料

动物：成年健康雄性 Wistar大鼠50只，体重150-180g，由中国医科大学实验动物中心提供。

主要试剂与仪器：氯化铈和三偏磷酸酶均购自sig ma公司；透射电镜（JEOL JEM-1200EX，日本）。

2.方法

2.1 实验动物及分组

成年健康雄性Wistar大鼠实验室条件饲养，随机分为4组，即无连续单一（single pr ol onged stress，SPS）刺激的正常对照组及SPS刺激组，其中SPS刺激后1d、7d和14d组为PTSD样大鼠组。

2.2 建立PTSD样大鼠SPS模型

该模型采用2005年日本文部省召开的"基础和临床的研究进展"的会议确定的关于PTSD模型-SPS刺激后无干扰喂养的方法。SPS刺激是指将大鼠连续进行下述步骤处理［8］，即：大鼠禁锢2 h后，立即强迫游泳20 min（水深40c m，水温24±1°C）。经过15 min的恢复，乙醚麻醉至意识丧失，在笼子中不再给予任何刺激，常规饲养直1d、7d和14d至取材。

2.3 酶组织细胞化学技术方法

2.3.1 灌流取材

乙醚麻醉正常和SPS各组Wistar大鼠，再用2%戊巴比妥强化麻醉，用0.01 mol／L PBS配制的0.25%戊二醛与2%多聚甲醛的混合液心脏灌流固定，取各组Wistar大鼠脑于同种固定液中固定1 h，然后浸于 Holt，S溶液（40%蔗糖，0.1 mol／L PBS配制）中2-3d至沉下。

（1）在改革开放和发展社会主义市场经济的条件下，思想意识出现了多元化的新特点，为精神文明建设带来了新的契机，同时也带来了诸多挑战。主要表现在市场经济条件下拜金主义、利己主义和享乐主义思想的负面作用，导致人们过多看重物质财富，忽视了精神追求，医务工作者也难以独善其身。

2.3.2 光镜酶组织细胞化学染色

将大鼠脑从Holt，S溶液中取出，于恒冷箱冰冻切片机（Leica CM1900）中行冠状切片，片厚10μm。孵育液配制：0.05 mol／L醋酸缓冲液20 ml（p H3.9）、氯化铈35.405 mg（用4 ml DH2O调制）、三偏磷酸酶15.29g、蔗糖 2.5g、Triton X-100 0.000075 ml、DH2 O 26 ml、总量为50 ml最终p H3.9。将各组切片分别置于上述孵育液中，37℃振动恒温水浴箱中孵育80 min。双蒸水充分漂洗，经1%硫化胺显色1 min，双蒸水再次漂洗干净，甘油明胶封片，根据鼠脑图谱［9］光镜镜检定位中缝背核、摄片。

2.3.3 电镜酶组织细胞化学染色

将大鼠脑中缝背核组织块从30%蔗糖溶液中取出，于恒冷箱冰冻切片机（Leica CM1900）中行冠状切片，片厚20μm 经0.01 mol／L PBS漂洗后，将各组切片分别置于上述孵育液中，37℃振动恒温水浴箱中孵育80 min。切片经0.01 mol／L PBS漂洗，1%锇酸后固定，常规透射电镜样品制备，根据鼠脑图谱光镜下定位中缝背核、超薄切片厚70n m，醋酸铀染色，于JEM-1200EX透射电镜下观察、摄片。

3.图像分析及统计学分析

每组随机抽取光镜酶组织细胞化学染色切片8张，每张测5个视野，利用LUZEXF图像分析系统，测T MP酶反应强度的平均光密度值。将所得图像分析数据和流式细胞仪检测结果均应用SPSS13.0软件包处理，进行单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.中缝背核神经元光镜TMP酶组化反应的变化

表1 各组大鼠中缝背核神经元T MP酶组化反应OD值比较（¯x±s）Table 1 The average of OD val ue of T MP enzy me histochemistry reaction in Dorsal raphe neuron of rats in each group（¯x±s）

2.中缝背核神经元电镜TMP酶组化反应的变化

正常对照组（图2 A）及SPS1d、7d和14d（图2B、C、D）大鼠中缝背核神经元T MP酶阳性反应产物为高电子密度的颗粒，分布于胞质内溶酶体上。正常对照组大鼠中缝背核神经元T MP酶阳性反应颗粒电子密度较高；SPS1d、7d和14d溶酶体上T MP酶阳性反应颗粒电子密度与正常对照组相比均有所增高，溶酶体膜性结构局部破损（图2B、C、D），并有部分反应颗粒向胞质内溢出。其中SPS7d胞质内溶酶体上T MP酶阳性反应颗粒电子密度更高、反应颗粒向胞质内溢出更明显（图2C）

讨 论

近年来PTSD发病和患病率高、慢性病程、疗效差等特点，严重影响创伤救治而备受关注［10］。中缝背核是中枢神经系统内源性镇痛系统的主要组成部分，具有广泛的纤维联系，其传出的部分投射纤维刺激中缝大核可使痛阈升高［11］，中缝背核在伤害性刺激中具有主要调节作用，中缝背核功能失调与PTSD的发病有一定关系。有研究报道，PTSD患者脑桥存在体积缩小和灰质密度减少［5］，中缝背核神经元可能存在细胞凋亡［6］，那么中缝背核神经元T MP活性表达是否有变化并与细胞凋亡是否有关？本实验通过建立大鼠SPS模型，应用光、电镜酶组化技术来检测正常组和SPS组中缝背核神经元细胞T MP活性表达的变化。溶酶体是细胞内重要的细胞器，其主要功能是清除细胞内的外源性异物及内源性残余物，以保护细胞的正常结构和功能。T MP酶是溶酶体的蛋白水解酶之一，也是溶酶体的标志酶，T MP酶表达的变化可以表示溶酶体的功能状态，细胞凋亡产物需要溶酶体酸性水解酶的处理。有实验表明［12］，凋亡细胞经历的和细胞光解损伤后经历的阶段极为相似，即溶酶体膜通透性增大，蛋白水解酶和蛋白激酶从中释放。使细胞变性、坏死过程进而加速，以清除凋亡的细胞。从本实验结果中可以看到，与正常对照组相比较，光镜下SPS1d、SPS7d和SPS14d各组中缝背核神经元T MP的活性均增强；电镜下SPS1d、SPS7d和SPS14d各组中缝背核神经元胞质内溶酶体上T MP酶阳性反应颗粒的电子密度均有增加，溶酶体膜有部分破损，T MP酶阳性反应颗粒向胞质内溢出，尤以7d最为明显。说明SPS后大鼠中缝背核神经元细胞可能受到了凋亡刺激，使得溶酶体膜变得不稳定，其渗透性发生了改变，底物可以渗入，T MP酶活性增强是中缝背核神经元处理凋亡产物的代偿，应激增加了中缝背核神经元的凋亡。提示溶酶体内TPM酶溢出释放到了细胞质中参与了细胞凋亡产物的降解和处理过程，TPM酶的增加有利于凋亡产物的清除。溶酶体吞噬消化细胞凋亡产物，致使中缝背核神经细胞数量减少，可能引起脑桥体积变小，致使中缝背核的功能障碍。

总之，研究结果表明创伤后应激障碍大鼠中缝背核神经元细胞TMP酶表达上调，提示TMP酶可能参与了PTSD样大鼠中缝背核神经元细胞凋亡产物的降解与处理。中缝背核细胞凋亡，可能是导致PTSD患者脑桥存在体积缩小和灰质密度减少的原因和情感行为异常的重要病理生物学基础之一。

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［7］Doty S B，Smith C E，Hand AR，et al：Inorganic tri metaphosphatase as a histochemical marker f or lysoso mes in light and electron microscopy.J Histoche m Cytochem，1977，25（12）：1381-1384

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Experi mental study on changes of TMP activity in dorsal raphe nucleus neurons of PTSD rats by light and electron microscopy

Liu Dongj uan1，Xiao Bing1，Xu Meng2，Han Fang3＊1，Shi Yuxiu1，3＊2
（1Depart ment of Electron Microscop y，College of Basic Medical Sciences，China Medical University；295 K Seven-Year System ，China Medical University；3Depart ment of Histology and Embr yology，College of Basic Medical Sciences，China Medical University，Shenyang 110001，China）

Objective To study the expression and distribution of T MP activity in the dorsal raphe nucleus of PTSD （posttrau matic stress disor der）rats.Met hods The SPS-method was used to set up t he rat PTSD models.Rats were rando mly divided into 1d，7d and 14d gr oups of SPS and the nor mal group.The changes of T MP activity and distribution of T MP in the dorsal raphe nucleus was detected by light micr oscopy and trans mission electr on micr oscopy（TEM）.Results T MP was widel y distributed t hr oughout the dorsal raphe nucleus region，mainly in the cytoplas m，appearing as buff y particles.Positive expression of T MP，highl y electron-dense black granules，was l ocated in l ysoso mes of all gr oups.Eval uation of T MP by enzy mohistoche mistr y indicated a significant increase in t he SPS model gr oups co mpared wit h t he normal control group（P＜0.05），which peaked in the SPS 7d group（P＜0.05）.Conclusion The expression of T MP significantly increases after SPS sti mulation in t he dorsal raphe neur ons of PTSD rats，which may indicate that T MP is involved in degradation and processing of the apoptotic products in the dorsal raphe nucleus.

Posttrau matic stress disor der；Dorsal raphe nucleus；Neur on；Thina mine monophosphatase

R322.81

A

10.3870／zgzzhx.2012.04.004

2011-12-18

2012-05-20

国家自然科学基金资助（31140060，81171282）；国家教育部博士点基金资助（20092104110016）

刘冬娟，女（1962年），汉族，副主任技师。

＊通讯作者（To who m correspondence should be addressed）