HOXA10基因在多囊卵巢综合症患者卵巢中的表达

何 泓 杨 意 张 艳 李 天 濮德敏＊ 钟 刚＊

HOXA10基因在多囊卵巢综合症患者卵巢中的表达

何 泓1，2杨 意1张 艳1李 天1濮德敏1＊钟 刚1＊

（1华中科技大学同济医学院附属同济医院妇产科，武汉430030；2广州医学院第三附属医院妇产科，广州510150）

目的 探讨HOXA10基因在卵巢中颗粒细胞的表达及其与多囊卵巢综合征的关系。方法 采用逆转录聚合酶链反应及免疫印迹法分别测定25例多囊卵巢综合征（PCOS）妇女和32例卵巢功能正常（Non-PCOS）妇女卵巢黄素化颗粒细胞中HOXA10 mRNA和蛋白的表达水平。结果 PCOS妇女黄素化颗粒细胞中HOXA10 mRNA的表达和蛋白的表达均低于Non-PCOS妇女（P＜0.01，P＜0.05）。结论 HOXA10基因在卵巢中有表达，PCOS妇女卵巢黄素化颗粒细胞HOXA10 mRNA和蛋白表达水平明显低于Non-PCOS妇女，提示该基因可能参与了PCOS的发生及发展过程。

HOXA10基因；卵巢颗粒细胞；多囊卵巢综合征

多囊卵巢综合征（Polycystic Ovar y Syndr o me，PCOS）是生育年龄女性生殖功能障碍性疾病，主要临床特征为持续性无排卵和高雄激素血症，育龄期女性PCOS患病率为5%-10% ，占无排卵性不孕症的50%-70%［1］。目前的研究认为，PCOS发病机制之一是卵巢原发性功能障碍［1］。近年研究表明，HOX基因也在卵泡的颗粒细胞及卵巢颗粒细胞瘤中有表达，与颗粒细胞的增殖有关［2］。目前已有不少研究探讨HOXA10基因在子宫内膜、胚泡种植和癌症中的作用，鲜见HOXA10基因与PCOS、卵巢功能调节的关系的报道。本文拟从超促排卵PCOS妇女卵巢颗粒细胞中HOXA10表达来揭示HOXA10基因与卵泡发育的关系。

材料和方法

1.研究对象和标本收集

1.1 研究对象

选择2011年6月-2011年12月在本院辅助生育病房行体外受精-胚胎移植（IVF-ET）助孕治疗的患者。研究组：PCOS患者25例，年龄（28.8±4.2）岁。参照美国生殖医学学会（ASRM）和欧洲人类生殖与胚胎学会（ESHRE）鹿特丹工作组修正的诊断标准，只要有以下3条中的2条，并排除引起高雄激素的其它疾病，就可诊断为PCOS：①无排卵或排卵不规则；②雄激素水平升高的临床（如多毛、痤疮）或生物化学改变的依据；③卵巢增大，每侧至少有直径2 mm～8 mm的小卵泡≥12个，或卵巢体积＞10 ml。排除其他内分泌疾病，如高泌乳素血症、先天性肾上腺皮质增生症、Cushing综合征和甲状腺功能亢进或低下等。对照组（Non-PCOS）：选择同期因丈夫无精症导致不孕的妇女32例，年龄（28.1±2.8）岁。纳入标准：月经周期正常，基础体温双相；超声检查子宫及双附件形态正常、无多囊卵巢的改变；基础内分泌无异常。以上实验对象均排除糖尿病家族史，并签署病人知情同意书。

1.2 IVF-ET方案及标本收集

所有患者促排卵周期均采用Gn RH-a／FSH长方案治疗，B超监测卵泡发育情况，当主导卵泡＝18 mm时，停用Gn RH-a（曲普瑞林，德国辉凌药业公司）和FSH（Gonal-F瑞士Ser ono公司），肌注 HCG 10000 IU，36 h穿刺取卵。取卵时分别收集大卵泡（直径＞1.6 c m）和小卵泡（直径＜1.4 c m）的黄素化颗粒细胞，留取无血污染的优势卵泡（直径≥1.8 c m）的卵泡液。

1.3 主要试剂

淋巴细胞分离液：天津市灏洋生物制品科技有限责任公司；红细胞裂解液：杭州博日科技有限公司；HOXA10兔抗人多克隆抗体：Santa Cr uz（美国）；兔抗人β-actin多克隆抗体：北京中山生物技术公司；HRP标记的羊抗兔二抗：北京中山生物技术有限公司；DMEM-F12培养基、胎牛血清：Hyclone（美国）；Trizol：Invitr ogen公司；引物：均由上海英骏生物技术有限公司合成；Taq酶、DNA Mar ker DL2000：TAKARA 公 司 ；RNAsin、d NTP、MMLV 逆转录酶、oligo d T Pri mer：pro mega公司。

2.方法

2.1 颗粒细胞的分离［3］

取出采集的卵泡液于室温下置于无菌试管中，300×g离心5 min，400×g离心5 min，弃上清去试管底部红细胞上细胞层；将所有沉淀物用PBS液制成悬液，另准备淋巴细胞分离液，按1：1比例将细胞悬液缓慢加入到淋巴细胞分离液上，以400×g离心20 min，吸取颗粒细胞层，再用红细胞裂解液洗涤红细胞，最后用PBS液洗涤，回收的颗粒细胞用灭菌磷酸缓冲液冲洗一次，获取的颗粒细胞悬浮于含有10%胎生牛血清DMEM（Gibro）中，0.04%台盼兰染色显示细胞活力，留取颗粒细胞存放在-70℃保存待测。

2.2 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）

取出提取好的颗粒细胞参照Trizol试剂说明提取各组细胞的总RNA进行逆转录反应。所用引物根据Genebank上所查询序列，用Pri mer5.0引物设计软件设计。扩增条件：94℃ 预变性5 min，PCR循环30个，94℃ 变性1 min，52℃退火45s，72℃ 延伸1 min，循环完成后，72℃延伸10 min。HOXA10引物序列为5＇-AAACCTGAACCGCTGTC-3＇，5＇-ACC AGC CCT GCA CAG ATG TAA C-3＇.所得c DNA进行PCR反应，取反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果并照像，凝胶成像系统分析灰度值，计算HOXA10与β-actin吸收峰面积之比值。

2.3 免疫印迹法（Western blotting）

每例新鲜提取的颗粒细胞标本取1×106细胞提取蛋白后采用BAC定量试剂盒测定蛋白浓度。SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白后转至硝酸纤维素膜；封闭缓冲液封闭后，加入抗人HOXA10多克隆抗体（1∶150）4℃孵育过夜。辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶2，000）在37℃温育1 h，TBS-T洗净后经显色液显示15 min，扫描后采用GDS28000型全自动凝胶成像分析系统（UVP，英国）对蛋白质条带，进行灰度分析。

3.统计学方法

所有实验均重复3次，数据以¯x±s表示，采用SPSS11.0统计软件，组间差异的比较采用t检验。

结 果

1.卵巢颗粒细胞中HOXA10 mRNA的表达

RT-PCR检测结果显示，两组卵巢黄素化颗粒细胞中均有HOXA10 mRNA的表达，PCOS组中黄素化颗粒细胞HOXA10 mRNA的表达显著低于Non-PCOS组（P＜0.01）（图1）。

2.卵巢颗粒细胞中HOXA10蛋白的表达

Wester n-blotting检测结果显示两组卵巢黄素化颗粒细胞中均有HOXA10蛋白的表达，PCOS组中黄素化颗粒细胞HOXA10蛋白的表达低于Non-PCOS组（P＜0.05）（图2）。

图1 卵巢黄素化颗粒细胞HOXA10 mRNA的表达。（A）为扩增产物电泳图，（B）为目的基因条带密度扫描的分析结果。（★：P＜0.01）图2 卵巢黄素化颗粒细胞HOXA10的蛋白表达。（A）HOXA10蛋白Western blotting图，（B）为目的基因条带密度扫描的分析结果。（＃：P＜0.05）Fig.1 The expression of HOXA10 mRNA in granulose cells（GCs）.（A）：RT-PCR analysis of HOXA10 in GCs，（B）：The relative absorbance of HOXA10 mRNA expression analysis histogram.（1：Non-PCOS，2：PCOS）（★：P＜0.01）Fig.2 The expression of HOXA10 protein in granulose cells（GCs）.（A）：Wester n blotting analysis of HOXA10 in GCs，（B）：The relative absorbance of HOXA10 protein expression analysis histogram.（1：Non-PCOS，2：PCOS）（＃：P＜0.05）

讨 论

HOXA10基因是一种与胚胎发育有关的基因，近年研究发现在成人的血液及生殖内分泌中也发挥作用［4］。目前的研究认为，PCOS发病机制之一是卵巢原发性功能障碍［1］，卵泡异常是PCOS的重要致病因素［5］，临床表现为长期无排卵或稀发排卵。PCOS患者卵泡发育障碍基本表现是卵泡募集数量较多、卵泡选择及优势化受阻、卵泡发育停滞及无排卵发生。而卵泡的发育和分化是受内分泌激素、卵巢内的调节因子和细胞-细胞间的相互作用严格调节的连续事件。新近研究证明，在卵母细胞和卵泡细胞间存在卵母细胞-颗粒细胞调节环，颗粒细胞提供营养和刺激卵母细胞的生长发育［6，7］。

研究证实HOXA10是子宫内膜容受及胚胎种植中的关键因子，已知HOXA10 mRNA表达于子宫内膜和肌层，但在卵巢上的表达与作用知之甚少。Ota等［2］发现HOXA7基因在卵泡的颗粒细胞及卵巢颗粒细胞瘤中有表达，随着卵泡逐渐成熟，HOXA7由原始卵泡颗粒细胞少量表达到初级卵泡中表达增多，暗示了它与颗粒细胞增殖的关系。钟刚等的研究发现：长期无排卵的患者子宫内膜HOXA10的表达降低［8］。本实验通过对超排卵治疗后PCOS妇女与Non-PCOS妇女卵巢黄素化颗粒细胞HOXA10检测，发现PCOS妇女卵巢颗粒细胞中HOXA10 mRNA和蛋白表达量显著低于Non-PCOS妇女。这个现象提示我们在PCOS妇女卵巢中HOXA10基因表达的下调暗示了HOXA10基因参与了PCOS妇女卵泡发育异常的发生。

PCOS妇女主要临床特征除无排卵或稀发排卵外，另一重要特征就是高雄激素血症，学者一致认为约有半数的PCOS妇女存在高雄激素血症，PCOS的发病机制与多种雄激素循环水平增高有关［9，10］。在对子宫内膜的研究中发现，睾酮和双氢睾酮能降低子宫内膜细胞株 HOXA10 mRNA水平［11］；且PCOS妇女分泌期子宫内膜HOXA10 mRNA水平显著降低［12］。总之，PCOS和高雄激素血症可以抑制子宫内膜HOXA10基因在月经周期分泌期的表达；高雄激素血症对HOXA10基因内分泌调节将干扰子宫内膜机能分化，导致生殖功能障碍。本实验提示我们PCOS和高雄激素血症对生殖的影响不单单只是在子宫内膜中HOXA10基因的表达异常，而且与卵巢中HOXA 10基因的表达异常密切相关。

由于本文的研究对象均为控制性超排卵的妇女，对于Gn RHa／Gn长方案控制性超排卵对卵巢HOXA10基因表达的影响需要进一步的研究。众所周知辅助生殖技术（ART）治疗计划通常是根据重组FSH（r FSH）的应用制定的，和正常未处理组比较，在ART周期中的小鼠分泌期子宫内膜HOXA10 mRNA水平无明显差异［13］；此外，实验发现雌激素-HOX信号的分子机制也是配体特异性的［14］。因此雌激素-HOX信号途径的特点给予ART一定的启示。

综上所述，PCOS妇女卵巢颗粒细胞中HOXA10 mRNA和蛋白表达量显著低于Non-PCOS妇女，揭示出这种客观变化现象不仅让我们了解到PCOS妇女卵巢中HOXA10基因表达的下调暗示了HOXA10基因参与了卵泡发育异常的发生，且HOXA10基因的表达可能受到睾酮、双氢睾酮、雌激素等的影响，甚至还存在个体特异性可能，并且性激素的影响是受体依赖性的，有助于启发我们研究影响卵泡的成熟的相关因子，为辅助生育技术提供新的启示。

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Expression of HOXA10 gene in women with polycystic ovarian syndrome

He Hong1，2，Yang Yi1，Zhang Yan1，Li Tian1，Pu De Min1＊，Zhong Gang1＊
（Depart ment of Obstetrics and Gynecology，Tongji Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science ＆ Technology，Wuhan 430030；2Depart ment of obstetrics and Gynecol ogy，Thir d hospital affiliated，Guangzhou Medical college，Guangzhou 510150，China）

Objective To deter mine t he i mpact of t he levels of HOXA10 in ovarian granul osa cells（GCs）on the pathogenesis involved in polycystic ovarian syndro me.Methods GCs were obtained during the oocyte retrieval fr o m a total of 57 wo men：25 wo men wit h PCOS，and 32 wo men wit h f unctional ovar y as the control group，.The mRNA expression of HOXA10 was measured by reverse transcription poly merase chain reaction（RT-PCR），and wester n blot analysis was used to detect t he expression of HOXA10 protein in GCs.Results The mRNA expression of HOXA10 in GCs was significantly lower in wo men with PCOS than in control（P＜0.01），and the protein expression of HOXA10 in GCs was also significantly l ower in wo men wit h PCOS than in contr ols（P＜0.05）.Concl usion The mRNA and pr otein expressions of HOXA10 in GCs were significantly lower in wo men with PCOS than in the control group，which suggests that HOXA10 may participate in t he pr ocess of PCOS.

HOXA10 gene；Ovarian granul osa cell；Polycystic ovarian syndro me

R711.6

A

10.3870／zgzzhx.2012.04.003

2012-01-13

2012-06-06

国家自然科学基金（81000240，30973205）；“重大新药创制”科技重大专项（2009ZX09103-739）。

何泓，女（1980年），汉族，博士研究生。

＊通讯作者（To who m correspondence should be addressed）