CXCL9对单个核细胞的趋化作用及其机制探讨

夏羽佳 田德安 曾丹 何嘉怡 涂炜 邓欢 韩平 邓玥灵 刘梅

CXCL9对单个核细胞的趋化作用及其机制探讨

夏羽佳 田德安 曾丹 何嘉怡 涂炜 邓欢 韩平 邓玥灵 刘梅＊

（华中科技大学同济医学院附属同济医院消化内科，武汉430030）

目的 观察趋化因子CXCL9对人外周血单个核细胞的趋化作用，并探讨其对CXCR3受体后信号通路的影响。方法 分离人外周血单个核细胞并进行培养，Transwell小室趋化实验检测不同浓度的趋化因子CXCL9对外周血单个核细胞的趋化作用；Wester n blot方法检测CXCL9刺激外周血单个核细胞时ERK1／2及PI3 K／Akt信号通路的蛋白表达变化，并检测上述通路抑制剂PD98059和Wort mannin处理细胞后，CXCL9对ERK1／2、PI3 K／Akt信号通路的影响有无变化。结果与空白对照组相比，不同浓度的CXCL9刺激对人外周血单个核细胞均有明显的趋化作用，并且CXCL9刺激人外周血单个核细胞能激活ERK1／2及PI3 K／Akt信号通路，其关键蛋白ERK1／2及Akt磷酸化水平显著增加；通路特异性抑制剂PD98059和Wort mannin的应用能明显抑制CXCL9对这两条信号通路的激活。结论 CXCL9能趋化人外周血单个核细胞发生迁移，ERK1／2及PI3 K／Akt信号通路可能在此过程中发挥重要作用。

趋化因子；CXCL9；单个核细胞；趋化作用；信号通路

我国乙型病毒性肝炎感染人数约为1.2亿，每年发生HBV感染的新病例超过280万，大量患者肝脏病变呈慢性化趋势［1］。慢性乙型肝炎的病理生理基础是大量的炎性细胞浸润肝组织，导致肝细胞损伤和坏死［2］。趋化因子是一类具有趋化和诱导功能的小分子多肽物质，根据靠近分子氨基端（N端）的前两个保守半胱氨基酸残基（Cys）的排列将其分为四个亚家族：2个半胱氨酸残基之间存在一个氨基酸残基称为CXC类，之间不存在氨基酸残基为CC类，之间插入三个其他氨基酸残基的为CX3C类，N端仅一个C的为C类［3］。趋化因子CXCL9（又名Mig）属于CXC趋化因子亚家族成员，在机体中发挥重要的生理和病理效应。其受体CXCR3主要在T细胞、B细胞、NK细胞表面表达，CXCL9通过与其受体CXCR3结合而招募炎症细胞到达炎症部位。既往研究表明，在慢性乙型肝炎患者肝组织和血标本中均存在CXCL9的表达异常［4］。本研究以正常人外周血单个核细胞为研究对象，旨在探讨趋化因子CXCL9对人外周血单个核细胞的趋化作用，及其对CXCR3受体后信号通路的影响。

材料和方法

1.材料

植物血球凝集素（PHA）、二甲基亚砜（DMSO）购自Sig ma公司；RPMI-1640培养基和胎牛血清购自Gibco公司；青霉素和链霉素购自碧云天公司；人淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物公司；人IL-2及CXCL9购自Peprotech公司；抗体购自美国CST公司。

2.方法

2.1 外周血单个核细胞（PBMCs）的分离和培养

无菌抽取健康志愿者静脉血15 ml经肝素抗凝后用等量1640稀释，小心加至人淋巴细胞分离液上，2000g离心20 min；收集第二层（浅黄色层）细胞，放入含PBS 5 ml的试管中，充分混匀，1500g离心10 min；最后用PBS漂洗3次，每次1000g离心5 min，所得沉淀即为外周血单个核细胞。用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液（含100 U／ml青霉素、100μg／ml链霉素）调整细胞浓度为2×106个／ml，并加入 PHA 和IL-2，终浓度分别为20μg／ml及400 U／ml，于37℃、5%CO2培养箱内振荡培养。

2.2 Trans well趋化实验

调整培养的细胞密度1×106个／ml，24孔Transwell趋化小室上室加入100μl细胞悬液，下室加入600μl趋化缓冲液（0.5%BSA、100U／ml青霉素、100μg／ml链霉素和RPMI-1640培养液）。实验分为四组：①空白对照组：小室上室加入培养的PBMCs，下室不加任何刺激；②50ng／ml CXCL9处理组；③100ng／ml CXCL9处理组；④200ng／ml CXCL9处理组：小室上室加入培养的PBMCs＋下室加入CXCL9，四组细胞均放置于37℃、5%CO2培养箱孵育4h，去膜，收集迁移到下室的细胞，并用血球计数板计数。

2.3 Wester n blot检测CXCL9对CXCR3受体后信号通路的影响

培养的单个核细胞分组：①空白对照组；②CXCL9（200 ng／ml）处理组；③Wort mannin（100n mol／L）30 min＋ CXCL9（200ng／ml）处理组；④PD98059（100μmol／L）＋CXCL9（200 ng／ml）处理组，提取各组蛋白并定量，分别检测CXCR3受体后信号通路关键蛋白ERK1／2、Akt总蛋白及磷酸化蛋白的表达。

3.统计学方法

应用SPSS13.0软件对所有数据进行统计学分析，结果以¯x±s表示，两组间均数比较用t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

1.体外趋化性分析

相对于空白对照组，不同浓度（50～200ng／ml）的CXCL9对PBMCs均有明显的趋化作用（P＜0.01），并且CXCL9趋化PBMCs迁移的数量呈浓度依赖性，差异有统计学意义。（见表1）

结 果

表1 CXCL9对人PBMCs迁移的影响（n＝3；¯x±s）Table 1 The effect of CXCL9 on migration of hu man PBMCs（n＝3；¯x±s）

2.CXCL9对ERK1／2、Akt的影响

与空白对照组相比，予CXCL9（200 ng／ml）刺激后，PBMCs中ERK1／2、Akt磷酸化蛋白的表达明显增强，但CXCL9对ERK1／2、Akt总蛋白表达无影响（见图2），表明CXCL9刺激能激活PBMCs的ERK1／2及PI3 K／Akt信号通路。预先分别使用ERK1／2及PI3K／Akt信号通路抑制剂PD98059和 Wort mannin处理后，再加入CXCL9刺激，可见ERK1／2、Akt蛋白磷酸化水平明显降低（见图2），总蛋白表达无明显改变，与单用CXCL9处理组相比差异具有统计学意义，这表明特异性信号通路抑制剂PD98059和Wortmannin能抑制CXCL9对ERK1／2及PI3 K／Akt信号通路的激活（P＜0.01）（见图3）。

图2 Western blot方法检测各组细胞中ERK1／2和Akt蛋白的表达Fig.2 Expression of ERK1／2 and Akt in each group detected by Wester n blot

图3 各组细胞中ERK1／2和Akt磷酸化蛋白表达的相对定量 ＊＊P＜0.01（1：空白对照组；2：200ng／ml CXCL9处理组；3：抑制剂PD98059／Wort mannin＋200ng／ml CXCL9处理组）Fig.3 Relative expression quantity of phosphorylate ERK1／2 and Akt protein in each group＊＊P＜0.01（1：Control group；2：200ng／ml CXCL9 treat ment group；3：PD98059／wort mannin＋200ng／ml CXCL9 treat ment gr oup）

讨 论

HBV本身并不直接引起肝细胞损伤，细胞免疫异常为 HBV感染后肝细胞损害的主要原因［5］。HBV感染宿主后机体产生针对病毒的特异性和非特异性免疫反应，特异性细胞毒T淋巴细胞对清除肝细胞内的病毒起重要作用，而非特异性免疫细胞则是导致肝细胞损伤的关键［6］。免疫细胞的定向迁移是机体免疫应答发生和完成的必须条件。趋化因子是一类控制细胞定向迁移的细胞因子，至今已发现近50种人的趋化因子，属细胞因子中的最大家族。从功能定义上趋化因子可以分为两大类：炎性趋化因子和微环境稳态趋化因子。炎性趋化因子在机体存在炎症刺激时，可吸引炎症细胞到达免疫应答局部从而发挥免疫反应［7］。CXCL9即为炎性趋化因子，其发挥作用主要通过受体CXCR3介导完成。CXCR3属于G蛋白耦联受体超家族，具有7个富含疏水氨基酸的α螺旋穿膜区结构，主要表达于记忆性T淋巴细胞和被激活的CD4、CD8、NK及NKT细胞表面。既往研究表明，CXCL9在创伤感染、病毒感染等多种疾病中高表达，其诱导大量非特异性炎性细胞达到炎症部位从而在Th1型免疫反应中发挥重要作用，在HBV转基因小鼠体内采用特异性抗体中和CXCL9后，能有效阻止非特异性炎性细胞浸润、减轻肝损伤［8］。此外，Bieche等人研究发现乙型肝炎和丙型肝炎患者肝组织中CXCL9表达水平较正常人群明显增高［9］。我们在既往研究中将包含乙型肝炎全基因组的质粒转染人肝癌细胞系Hep G2后，CXCL9表达量明显增加，这提示HBV具有诱导CXCL9表达的功能［10］。本研究在体外趋化实验中证明，相对于空白对照组，不同浓度的CXCL9可高亲和力的结合体外活化的PBMCs表面的CXCR3受体，诱导PBMCs发生趋化性迁移，并且在CXCL9浓度为50-200ng／ml时所趋化的PBMCs数量呈剂量依赖性。这些研究结果提示，CXCL9可能在HBV感染后炎性细胞浸润，导致肝组织损伤中发挥重要作用。

与其他趋化因子家族成员类似，CXCL9与CXCR3受体结合后通过G蛋白耦联继而激活下游信号转导通路［11］。PI3K是一类特异性磷酸化肌醇磷脂3位羟基的激酶，参与多种信号通路，在调节细胞增殖、分化、迁移中具有重要作用［12］。细胞外信号调节激酶（ERK）是丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）家族中最重要的成员之一，目前在多种类型的细胞中已发现多种趋化因子与其受体结合后可激活ERK1／2信号通路［13］。本研究发现，CXCL9能诱导活化的人外周血单个核细胞上ERK1／2及PI3 K／Akt信号通路的激活，ERK1／2和Akt磷酸化蛋白水平明显增加；分别采用ERK1／2和PI3 K／Akt信号通路特异性抑制剂PD98059及Wort mannin处理后，它们能阻断CXCL9对ERK1／2及PI3 K／Akt信号通路的激活，这表明ERK1／2及PI3 K／Akt信号通路可能与CXCL9对人外周血单核细胞的趋化作用有关。

综上所述，CXCL9能趋化人外周血单个核细胞的迁移，并且迁移细胞数与CXCL9的浓度呈正相关；CXCL9刺激人外周血单个核细胞与其表面CXCR3受体结合后可激活下游ERK1／2和PI3 K／Akt信号通路，特异性信号通路抑制剂能抑制CXCL9对ERK1／2及PI3 K／Akt信号通路的激活。本实验对趋化因子CXCL9对人外周血单个核细胞的趋化作用及其机制进行了初步探讨，为进一步在整体水平对CXCL9的作用及其机制的研究提供了实验基础。

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Chemotaxis of CXCL9 to human peripheral blood mononuclear cells and its mechanism

Xia Yujia，Tian Dean，Zeng Dan，He Jiayi，Tu Wei，Deng Huan，Han Ping，Deng Yueling，Liu Mei＊
（Depart ment of Gastroenterology，Tongji Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China）

Objective To investigate the chemotaxis of CXCL9 to hu man peripheral blood mononuclear cells（PBMCs）and explore its signaling pathway.Methods PBMCs were isolated and cultured.The che motaxis of CXCL9 to PBMCs was measured by Trans well assay.Wit h CXCL9 treat ment，the expression of ERK1／2 and Akt protein were detected in PBMCs by Wester n blot analysis.After inhibitor PD98059 or Wort mannin treat ment，t he changes of ERK1／2 and Akt pr otein were deter mined.Results Co mpared wit h t he contr ol，migration of PBMCs was obser ved in response to CXCL9 treat ment after t he 4h ti me frame of the experi ment.In addition，the ERK1／2 and PI3K／Akt signaling pathways were activated and t he phosphor ylated ERK1／2 and phosphor ylated Akt were substantially increased.The ERK1／2 and PI3K／Akt inhibitors（PD98059 and Wort mannin）suppressed the activation of the t wo signaling pathways induced by CXCL9.Concl usion CXCL9 induces t he migration of PBMCs，and ERK1／2，PI3 K／Akt signaling pat h ways may play an i mportant role in this pr ocess.

Chemokine；CXCL9；Mononuclear cell；Chemotaxis；Signaling path way

R349.54

A

10.3870／zgzzhx.2012.04.001

2012-01-09

2012-05-10

国家自然科学基金资助（30972759，810703-33）

夏羽佳，女（1984年），汉族，博士。

＊通讯作者（To who m correspondence should be addressed）