CD151蛋白激活Rac／Cdc42通路并促进血管生成

彭 丹 左后娟 秦 瑾 刘正湘＊ 汪道文 张 欣

CD151蛋白激活Rac／Cdc42通路并促进血管生成

彭 丹1左后娟2秦 瑾2刘正湘2＊汪道文2张 欣3

（1华中科技大学同济医学院附属同济医院核医学科，2心血管内科，武汉430030；
3美国田纳西州大学健康科学中心医学系、癌症研究所、血管生物学研究中心，TN 38163）

目的 研究CD151及其突变体CD151-AAA194-196对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）增殖及激活Rac／cdc42通路的影响，探讨CD151促血管生成的机制。方法 构建p AAV-CD151及其突变体p AAV-CD151-AAA194-196（整合素结合缺陷突变体），测序成功后分别转染入HUVEC。CCK-8法测定p AAV-CD151及其突变体p AAV-CD151-AAA194-196在HUVEC中增殖的能力，Western Blot方法检测CD151及突变体转染后CD151蛋白的表达及对激活Rac／Cdc42通路的影响。结果p AAV-CD151组的CD151蛋白表达高于正常对照组、p AAV-GFP组，但p AAV-CD151组及p AAV-CD151-AAA194-196组之间CD151蛋白表达没有统计学意义（P＞0.05）。CCK-8检测结果示：Control组、p AAV-GFP组、p AAV-CD151组、p AAVCD151-AAA194-196组 OD值分别为1.491±1.780、1.403±1.776、2.742±2.49和1.66±1.845。p AAV-CD151组较p AAVGFP组和Control组细胞增殖能力明显增强（P＜0.01），p AAV-CD151-AAA194-196组较p AAV-CD151组细胞增殖能力减弱（P＜0.05）。此外，p AAV-CD151组中 P-Rac／cdc42表达较p AAV-GFP组和正常对照组明显增加（P＜0.01），p AAV-CD151-AAA194-196组较p AAV-CD151组P-Rac／cdc42表达降低（P＜0.05）。结论 CD151通过与整合素形成功能性复合体机制促进Rac／Cdc42通路的激活，进而促进血管生成作用。上述机制可能为CD151促血管生成的重要机制。

CD151；脐静脉内皮细胞；血管生成；整合素

CD151是细胞信号转导、粘附和运动中关键的分子之一［1-3］。大量的研究均证实CD151能促进血管生成［4-6］，但其作用的分子机制仍不清楚。CD151通过胞外大环特异性位点QRD194-196与多种整合素亚基特异性结合形成CD151-整合素复合体，此复合体被认为是CD151信号转导的重要结构基础。Rho家族属于Ras超家族，主要包括Rho（包括Rho A、RhoB和Rho C）、Rac和Cdc42三个亚家族，是重要的细胞内信号分子，Rac是血管生成过程中调节内皮细胞增殖、迁移的主要信号转导分子，包括1，2，3亚型，其每种亚型通过其他方式参与血管生成的过程［7］；Cdc42作为Rho家族主要成员之一可以促进细胞间的粘附，信号转导及细胞增殖［8］。在本研究中我们构建了PAAV-CD151-AAA194-196突变体，即CD151的第194到196个氨基酸的突变，该突变体为整合素结合缺陷突变体，将破坏CD151与整合素的结合［9］。本研究通过检测CD151及其突变体在人脐静脉内皮细胞中的作用，进一步对CD151促进血管生成的相关分子机制进行探讨。

材料和方法

1.材料

1.1 细菌和质粒

p ZeoSV-CD151由美国Tennessee大学惠赠。p AAV-CD151 重 组 质 粒 以 及 p AAV-CD151-QRD194-196通过基因位点突变成功构建了整合素结合缺陷的p AAV-CD151-AAA194-196突变体。通过基因测序，证实了我们成功构建了上述突变体。（人脐静脉内皮细胞株购于武汉大学物种保藏中心）。

1.2 主要试剂

Fugene-HD转染试剂购于BD公司（美国），琼脂糖agarose，胰蛋白酶（Trypsin），DMEM／F12，胎牛血清（FBS）等均购于Gibco公司；DNA回收试剂盒，Ba m HI，NotI限制性内切酶，d NTP和 DNA Mar ker购于大连宝生物有限公司（Ta Ka Ra Biotechnology）；二甲基亚砜，DNA电泳琼脂糖，溴乙啶购自Sig ma公司；CCK-8购于Bio mol公司；Realti me PCR Master Mix（日本 TOYOBOCO 公司）；羊抗人CD151抗体（美国Santa Cr uz公司）、PVDF膜（美国Life Science公司）；化学发光试剂ECL（Pirce公司）；抗p-Rac／Cdc42、Rac1／2／3、Cdc42、βactin抗体（美国Santa Cruz公司）。按照三质粒共转染方法在人脐静脉内皮细胞（HUVECs）包装和复 制 生 成 p AAV-CD151，p AAV-CD151-AAA194-196和p AAV-GFP3种质粒。

1.3 仪器

凝胶成像系统 Gene Genius Bio I maging Sys-tem为Synegene公司产品；微量紫外分光光度计美国Bio-Rad公司；PCR仪美国Beck man公司；台式高速低温离心机Beck man美国公司；微型离心机（美国 Sig ma公司）；Bio-RAD 电泳仪（美国 Bio-RAD公司）；JA1003型电子天平（武汉医用仪器公司）；DKZ-2电热恒温震荡水槽（上海医用电子仪器厂生产）；荧光倒置显微镜为日本NIKON公司产品；超低温冰箱（美国Revco公司）；HQ-45型恒温摇床（中科院武汉科学仪器厂生产）。

2.方法

2.1 p AAV-CD151 重 组 质 粒 以 及 p AAVCD151-AAA194-196的构建及酶切鉴定

p AAV-CD151重 组 质 粒 以 及 p AAV-CD151-AAA194-196突变体质粒。碱裂解法提取质粒并纯化，鉴定目的片段测其纯度和含量。取纯化的质粒10μl，BamHⅠ、NotⅠ双酶切，建立酶切反应体系，混匀37℃温浴3h后，0.1﹪琼脂糖凝胶电泳鉴定。55V电泳40 min，紫外灯下检测，摄片。

2.2 p AAV-CD151 重 组 质 粒 以 及 p AAVCD151-AAA194-196测序。

重组质粒经Ba m HⅠ、NotⅠ双酶切证实含有目的基因片段后，将阳性克隆送北京奥科生物科技有限公司DNA测序并用blast工具对比测序结果。

2.3 p AAV-CD151 重 组 质 粒 以 及 p AAVCD151– AAA194-196质粒的转染

人脐静脉内皮细胞（HUVEC）置于DMEM／F12（含10%胎牛血清），HUVECs分别分为对照组，p AAV-GFP 组，p AAV-CD151 组，p AAVCD151-AAA突变体四组。将以上样本置于37℃，5%CO2孵箱中培养。分别用非脂质体质粒转染试剂FUgene HD转等体积 PBS（未转染组）、p AAVGFP、p AAV-CD151-AAA、p AAV-CD151，将 质 粒终浓度为2μg／100μl然后加入FUgene HD转染试剂6μl／100μl。使质粒和FUgene HD转染试剂的比例保持1：4（质量／体积），按照100μl体系溶于 OPTI M-DMEM中，轻轻混匀后，室温下孵育15 min后，放入细胞长至70%-80%密度的六孔板中37℃，5%CO2培养箱。转染48 h后收集部分细胞用于检测目的基因蛋白的表达。

2.4 Wester n bl ot测定转染后CD151蛋白的表达及对Rac1／Cdc42通路的影响

将待测的细胞用预冷的1×PBS洗2次，三去污细 胞 裂 解 缓 冲 液 （50 mmol／LTris-Hcl p H8.0，150 mmol／LNaCl，0.02%Na N3，0.1%SDS，100μg／ml PMSF，1μg／ml Aprotinin，1%NP-40，0.5%去氧胆酸钠）150μl裂解细胞，用Brandforad法测定细胞裂解液中的总蛋白含量。每组取约40μg蛋白质在15%SDS-PAGE凝胶上电泳分离，4℃下电转移至PVDF膜上。检测四组样品的CD151蛋白及Rac1、2、3／Cdc42信号分子的表达情况。CD151蛋白表达以β-actin为内参照。取含等量蛋白质的裂解液加等体积2×加样缓冲液（不含2一巯基乙醇）进行SDSPAGE电泳，电泳结束后在25 V、4℃条件下过夜将凝胶上的蛋白质转移到PVDF膜上，37℃1%脱脂奶粉封闭2.5 h，加入CD151蛋白、或Rac1、2、3／Cdc42抗体、或P-Rac／cdc42抗体4℃孵育过夜，1∶5000的辣根过氧化物酶标记的抗羊二抗室温孵育2h。用发光试剂ECL按试剂说明书要求显影、曝光，并用凝胶成像分析系统灰度扫描来定量检测蛋白质的相对表达量，各组数据均用相应β-actin进行标准化处理。

2.5 CCK-8法测定细胞增殖能力

将转染24h、48h后70-80%密度96孔板的HUVEC上分成4组，分别为空白对照组，p AAVGFP，p AAV-CD151及p AAV-CD151-AAA194-196突变体四组，每组设立5个复孔，每孔加入10%CCK-8 1μl，在 室 温 下 静 至 1h 后 在 自 动 酶 标 仪（ELX-800 Bio TEK）测定 各孔490n m 处 OD 值。以只加培养基，不加细胞的空白对照孔调零。

3.统计学处理

计量资料结果均以¯x±s表示，Wester n bl ot的结果用凝胶成相分析系统测定蛋白条带的相对光密度值，每组实验均重复3次，用t检验进行差异显著性分析。对校正的OD值进行单因素方差分析，两组间计量资料比较采用t检验。P≤0.05有显著差异有统计学意义。

结 果

1.p AAV-CD151质粒鉴定

p AAV-CD151经Ba m HⅠ／NotⅠ双酶切后电泳图可见PAAV-GFP酶切结果，酶切后可见4200bp的载体片段和500bp的目的片段和CD151基因残余片段约300bp（图1）；所构建p AAVCD151-AAA目的片段长度亦约500bp。GFP与载体相连，酶切结果和预期相符。

2.p AAV-CD151-AAA194-196突变体测序鉴定

证实 CD151，CD151-AAA194-196突变体与未突变的PAAV-CD151-HA相比，前者的第194至第196个氨基酸由QRD突变为AAA，相应的局部DNA序列也由CAGCGAGAC突变为GCGGCAGCC（图2）。

3.CD151蛋白的表达

Wester n-bolt分析 CD151用β-actin进行标准化处理后，结果显示p AAV-CD151组与p AAVCD151-AAA组比较无显著差异，但较对照组与p AAV-GFP组稍有增加。正常对照组与p AAVGFP组比较无显著差异（P＜0.05），见（图3）。

图3 CD151蛋白表达的Wester n blot分析和相对吸光度值 p AAV-CD151-AAA VS CD151组，并不影响其CD151基因表达。Fig.3 CD151with the protein expression of and relative absorbance analysis histogram.p AAV-CD151-AAA VS CD151group，Donnot effect CD151 gene expression.

4.细胞增殖能力分析

各质粒转染24h、48h后，分别检测正常对照组，p AAV-GFP 组，p AAV-CD151 组 及 p AAVCD151-AAA194-196突 变 体 组 细 胞 的 OD 值 分 别为1.491±1.780、1.403±1.776、2.742±2.49和1.66±1.845。结果显示在转染 HUVEC 中，p AAV-CD151组细胞增殖能力显著较对照组和GFP组增加，而p AAV-CD151-AAA组细胞增殖能力则明显低于p AAV-CD151组（图4）。

图4 CCK-8法检测细胞增殖能力测定结果直方图分析＊p AAV-CD151 VS p AAV-Control and p AAV-GFP ，p AAV-CD151组明显促进细胞的增值，（P＜0.01）。有显著的统计学意义。＃ p AAV-CD151-AAA VS＊ p AAVCD151（P＜0.05）。有显著的统计学意义。Fig.4 The result analysis of the proliferation activity of HUVEC ＊p AAV-CD151 VS p AAV-Control and p AAVGFP，p AAV-CD151group was significantly pro mote cell proliferation and statistical significance（P＜0.01）.＃p AAVCD151-AAA VS＊CD151.was significantly statistical significance（P＜0.05）.

5.Rac1／2／3、Cdc42、P-Rac／cdc42信号分子在Wester n blot的分析

P-Rac／cdc42组，p AAV-CD151蛋白表达显著高于对照组、p AAV-GFP组（P＜0.05），而p AAVCD151-AAA组较CD151组明显降低。结果说明CD151基因转染促进CD151蛋白表达。促进Rac1／2／3、Cdc42磷酸化激活，而p AAV-CD151突变体则减弱ac1／2／3、Cdc42磷酸化激活（图5）。

图5 CD151、在Rac1／2／3、Cdc42、P-Rac／cdc42信号分子表达的 Wester n blot分析 A-C：以β-actin为内参照；各组与对照组比较，组间 Cdc42和 Rac1／2／3无显著性差异。＊p AAV-CD151组 VS Control、p AAV-GFP组 P-Rac／cdc42表达显著增强；＃ p AAV-CD151-AAA组P-Rac／cdc42表达水平低于＊p AAV-CD151组。Fig.5 The expression of CD151、Rac1／2／3、Cdc42 and P-Rac／cdc42 in HUVECA-C：To-actin as an internal reference；each group co mpared with contr ol group，Cdc42 and Rac1／2／3 no significant difference.＊p AAV-CD151 group VS Control and p AAV-GFP gr oup the P-Rac／cdc42 pr otein expression was significantly enhanced.＃p AAV-CD151-AAA gr oup t he P-Rac／cdc42 pr otein expression levels lower than p AAV-CD151 group.

讨 论

血管生成（angiogenesis）是指在机体生长发育过程中或创伤修复、缺血缺氧和炎症等情况下，原有微血管内皮细胞（endothelial cell，EC）经过生芽、迁移、增殖与基质重塑等形成新毛细血管的过程［10］。大量的体外实验证明，CD151具有促进大鼠后肢缺血模型血管新生和缺血心肌的血运重建并改善心脏功能的作用［11］；最近研究发现CD151能够特异性通过胞外大环AAA194-196位点与整合素α3或α6相连，从而构成CD151-整合素复合体，如果该位点的氨基酸序列发生突变则会影响CD151-整合素复合体的形成［9，11］。研究证实 CD151分子的 AAA194-196位点发生突变后，CD151与整合素α3／α6形成复合体的能力明显减弱［9］，这为整合素分子在促 HUVECs生长，迁移过程中的相互关系提供了理论观点。此外，CD151通过形成CDl51-整合素-复合体从细胞外向细胞内传递迁移信号来影响血管的作用［12］。文献报道在缺乏整合素关联蛋白（如αβ3等）时，Rac亚型在血管生成的过程中起着重要的作用［13］。另一方面Rac和Cdc42也在肿瘤血管生成中发挥着更为重要的作用［14］。根据上述，我们提出假设：CD151蛋白促进血管的生成及重建机制可能与CD151-AAA194-196位点与整合素相互影响产生的连锁效应。具体机制可能与整合素和CD151下游的 Rac1／2／3、Cdc42、P-Rac／cdc42等信号通路介导相关。为进一步研究CD151-AAA如何通过整合素功能性复合体影响血管生成的机制提供了理论依据，为揭示CD151-AAA影响血管生成可能与缺乏整合素关联蛋白介导相关并影响其能力。我们构建了p AAV-CD151-AAA194-196突变体（整合素结合缺陷突变体）。通过基因测序，证实了我们成功构建了突变体。此外，我们观察突变体在HUVEC的增殖和血管生成能力的效应，并在机制上进一步采用Wester n-blot方 法 检 测 CD151、CD151-AAA 及Rac1／2／3、Cdc42、P-Rac／cdc42等信号通路蛋白的表达水平，从而探讨CD151-AAA与血管生成经典通路的关系以及与整合素复合体的可能机制。结果显示 CD151及 CD151-AAA194-196突变体的蛋白质表达明显增加，表明外源性CD151基因能够在人脐静脉内皮细胞中有效表达。但细胞增殖CCK-8检测结果显示CD151突变体组的增殖能力明显低于CD151组，与对照组和GFP组相比较能力稍高，上述结果说明了CD15-AAA194-196突变体基因不影响CD151蛋白的表达，该突变体破坏CD151与整合素的结构，从而影响细胞增殖的能力，可能与整合素复合体结构发生改变后介导了促细胞增殖的能力。为进一步研究CD151和整合素在促血管形成中的作用奠定了基础。本研究中发现，CD151蛋白虽促进P-Rac／cdc42的 磷 酸 化 激 活，但 CD151-AAA194-196突变体组P-Rac／cdc42的激活则较CD151组减弱，提示整合素结构发生改变后介导了信号分子的激活，CD151促血管形成作用的调节机制与整合素关联蛋白（如Rac亚型和Cdc42）密切相关。也证明了CD151-AAA194-196突变体与整合素的结构和功能关系。为我们进一步对整合素影响血管生成的具体效应和机制提供了有力的证据。

［1］Zhang XA，Bontrager AL，He mler ME，et al.Trans membrane 4 superfa mily proteins associate with activated protein kinase C（PKC）and link PKC to specific be-

ta1 integrins.J Biol Chem，2001，276：25005-25013

［2］Shigeta M，Sanzen N，Ozawa M，et al.CD151 regulates epithelial cell-cell adhesion through PKC-and Cdc42-dependent actin cytoskeletal.reorganization.J Cell Biol，2003，163（1）：165-176

［3］Testa JE，Brooks PC，Lin JM，et al.Eukar yotic expression cloning with an anti metastatic monoclonal antibody identifies a tetraspanin（PETA-3／CD151）as an effector of hu man tu mor cell migration and metastasis.Cancer Res，1999，59：3812-3820

［4］Zheng Z，Liu Z.CD151 gene delivery activates PI3K／Akt pathway and pro motes neovascularization after myocardial infarction in rats.Mol Med，2006，12（9-10）：214-220

［5］Zuo H，Liu Z，Liu X，et al.CD151 gene delivery after myocardial infarction pro motes f unctional neovascularization and activates FAK signaling.Mol Med，2009，15（9-10）：307-315

［6］Zheng Z Z，Z X Liu.CD151 gene delivery increases e NOS activity and induces ECV304 migration，proliferation and t ube for mation.Acta Phar macol Sin，2007，28（1）：66-72

［7］Tan W，pal mby TR，Gavan J，et al.An essential role for Rac1 in endothelial cell f unction and vascular development.FASEB J，2008，22（6）：1829-1838

［8］Czuchra A，Wu X，Meyer H，et al.Cdc 42 is not essential f or filopodiu m f or mation，directed migration，cell polarization，and mitosis in fibroblastoid cells.Mol Biol Cell，2005，16（10）：4473-4484

［9］Kazarov AR，Yang X，Stipp CS，et al.An extracellular site on tetraspanin CD151 deter mines 3and 6 integrindependent cellular mor phology.J Cell Biol，2002，158：1299-1309

［10］Dvorak HF.Angiogenesis：update 2005.Jour nal of Thro mbosis and Haemostasis，2005，3（8）：1835-1842

［11］Nishiuchi R，Sanzen N，Nada S，et al.Potentiation of the ligand-binding activity of integrin alpha3beta1 via association wit h tetraspanin CD151.Proc Natl Acad Sci U S A，2005，102（6）：1939-1944

［12］Serru V，Le Naour F，Billard M，et al.Selective tetraspan-integrin co mplexes （CD81／alpha4beta1，CD151／alpha3beta1，CD151／alpha6beta1）under conditions disr upting tetraspan interactions.Biochem J，1999，340（Pt 1）：103-111

［13］D’Amico G，Robinson SD，Ger main M，et al.Endothelial-Rac1 is not required f or tu mor angiogenesis unlcess alphav beta3-integrin is absent.PLoS One，2010，5（3）：9766

［14］Soga N ，Namba N ，Mc Allister S，et al.Rho family GTPases regulate VEGF2 sti mulated endothelial cell motility.Exp Cell Res，2001，269（1）：73-87

CD151 protein activates Rac／Cdc42 pathways and Promotes angiogenesis

Peng Dan1，Zuo Houj uan2，Qin Jin2，Liu Zhengxiang2＊，Wang Daowen2，Zhang Xin3
（1Tongji Hospital Tongji Medical college Huazhong University of Science and Technology，Depart ment of nuclear Medicine；2Car diology，wuhan，430030；3The united states University of Tennessee Health Science Center，Depart ment of Medicine，The institute of cancer research，Vascul ar biology research center，T N 38163）

Objective To investigate t he eff ect of CD151 and CD151-AAA194-196mutant on t he pr oliferation and activation of Rac／Cdc42 pat h way in hu man u mbilical vein endot helial cells，and（HUVEC）to expl ore t he mechanis m of CD151 in angiogenesis.Met hods We constr ucted p AAV-CD151 and p AAVCD151-AAA194-196（integrin-binding def ective mutant），were transfected t he m into HUVEC.The expression of CD 151 and the effect on Rac／Cdc42 pat h ways were measured by wester n bl ot.Pr olif eration ability of HUVECs was measured by Cell Counting Kit-8 assay.Results The expression of CD151 pr otein in p AAV-CD151 and p AAV-CD151-AAA194-196gr oups was not statistically significant （P ＜0.05）.Cell Counting Kit-8 assay showed t hat the OD val ues in contr ol，p AAV-GFP，p AAV-CD151，and p AAVCD151-AAA194-196gr oups were 1.491±1.780，1.403±1.776，2.742±2.49 and 1.66±1.845，respectively.The cell pr oliferation in t he p AAV-CD151 gr oup were significantly increased t han in contr ol and p AAV-GFP groups（P ＜0.01）.The prolif eration of t he p AAV-CD151-AAA194-196group was decreased co mpared wit h t hat of the p AAV-CD151 gr oup（P＜0.05）.In addition，the protein expression of phospho-Rac／Cdc42 in the p AAV-CD151 group was significantly higher than that in the control and p AAV-GFP groups（P＜0.01）.But，in the p AAV-CD151-AAA194-196group，the protein expression of phospho-Rac／Cdc42 was significantly decreased（P＜0.05）.Concl usion It is i mportant f or CD151 to bind wit h t he integrins to pr o mote t he activation of Rac／Cdc42 signaling pat h ways in angiogenesis.This appr oach may be a new mechanis m in CD151-mediated angiogenesis.

CD151；HUVEC；Angiogenesis；Integrin

R322.123

A

10.3870／zgzzhx.2012.04.005

2012-02-14

2012-05-20

国家青年科学基金资助（81000047；81000139）

彭丹，女（1985年），汉族，硕士研究生。

＊通讯作者（To who m correspondence should be addressed）