Hep G2及其克隆形成细胞端粒酶活性的异质性研究

于树娜 王宝松 姜红心 史才兴 郑 洁 蒋吉英

Hep G2及其克隆形成细胞端粒酶活性的异质性研究

于树娜 王宝松 姜红心1史才兴 郑 洁2蒋吉英＊

（潍坊医学院解剖学教研室；1潍坊医学院形态学实验室；2潍坊医学院病理学教研室 山东261053）

目的 研究端粒酶在肝癌细胞株Hep G2及其克隆形成细胞中的表达，探讨不同增殖能力的肝癌细胞中端粒酶活性的异质性，为肝癌的诊断以及治疗提供新的思路。方法 利用软琼脂克隆形成实验富集分离人肝癌Hep G2细胞的克隆形成细胞；常规培养Hep G2及其克隆形成细胞，利用免疫细胞化学、Western blotting和RT-PCR检测h TERT蛋白和mRNA在Hep G2细胞及其克隆形成细胞中表达的异质性。结果 ①HE染色显示，克隆形成细胞的胞核较Hep G2细胞大，核仁明显；细胞伸出较多的细长突起，并连接形成网状。②免疫细胞化学染色显示，h TERT在Hep G2细胞的表达以细胞质为主，克隆形成细胞则以细胞核为主。③Western blotting和RT-PCR结果显示，克隆形成细胞中h TERT蛋白质和mRNA的表达均高于Hep G2细胞。结论 ①h TERT在Hep G2细胞及其克隆形成细胞中的表达存在异质性，且在克隆形成细胞中表达较高。②h TERT在Hep G2细胞及其克隆形成细胞中的表达模式提示克隆形成细胞具有肝癌干细胞的特征。

肝癌；h TERT；异质性；肿瘤干细胞

肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，其发病机制尚不清楚。近年来的一些研究报道，肝癌的发生与肝干细胞有密切的关系［1-3］。但由于缺乏直接的证据，对肝癌干细胞的存在至今尚有争议。本实验室前期研究了肝癌组织和Hep G2细胞在信号传导通路、多药耐药及药敏等方面的异质性［4-6］。但对于端粒酶在Hep G2细胞与克隆形成细胞活性的异质性研究，尚未见报道。因此，本课题拟采用Hep G2作为研究对象，用软琼脂克隆形成实验筛选克隆形成细胞，采用免疫细胞化学、Wester n blotting、RT-PCR等方法，研究克隆形成细胞与Hep G2细胞h TERT表达的差异，以期为肝癌干细胞的存在提供理论依据。

图1 Hep G2细胞及其克隆形成细胞的形态（A，B：HE染色；C，D：免疫细胞化学染色，×400）A，C：Hep G2细胞；B，D：克隆形成细胞Fig.1 Morph of Hep G2 cells and its colony-for ming cells（A，B：HE staining；C，D：i mmunocytochemistry staining，×400）A，C：Hep G2 cells；B，D：colony-for ming cells

材料和方法

1.材料

人肝癌Hep G2细胞株由本校免疫学教研室梁淑娟博士惠赠。DMEM高糖培养基（美国GIBCO公司），低熔点琼脂（上海 YITO Bio-instr u ment公司），胎牛血清（杭州四季青生物技术有限公司），胰蛋白酶（美国Sig ma公司），兔抗人 TERT（Santa Cr uz公司），Western blotting检测试剂盒（上海生工生物工程技术服务有限公司）、RT-PCR试剂盒（上海生工生物工程技术服务有限公司）。

2.方法

2.1 软琼脂克隆

以1%的琼脂糖凝胶作为储备胶，冷却至50℃时，与培养基按比例混合配制0.6%的底层胶铺于培养皿中；再冷却至42℃时，按比例与细胞悬液混合，0.2%的上层琼脂。待上层琼脂凝固后在其表面覆盖一层完全培养基以防止琼脂表面干燥，然后放入细胞培养箱中培养，每日镜下观察，并补充培养基，约2周后取出分离单个细胞克隆群落进行培养。

2.2 h TERT免疫细胞化学染色

常规SABC法免疫细胞化学染色，h TERT一抗浓度为1：200，以PBS代替一抗作为阴性对照，DAB呈色，苏木素复染，中性树胶封片。

2.3 免疫蛋白印迹（Western blotting）

用RIPA裂解液裂解各组细胞，提取总蛋白，用BCA法检测各组蛋白浓度，取50μg总蛋白进行聚丙烯凝胶电泳，转膜、5%脱脂奶粉封闭1h（4℃）；滴加多克隆抗体（兔抗h TERT多克隆抗体以及β-actin单克隆抗体均为1：100稀释），4℃过夜；TBST洗膜15 min×4；滴加HRP标记的山羊抗兔Ig G，室温2h，TBST洗膜15 min×4；将ECLipse试剂盒中的A液和B液等体积混合，按0.1 ml／c m2均匀加至PVDF膜上，充分混匀，用保鲜膜包好，将蛋白面向上，固定于暗盒中，暗室内曝光、洗片，以蛋白Mar ker为参照，确定目的蛋白，蛋白的相对含量用所检测蛋白与β-actin的灰度比值表示。

2.4 RT-PCR

利用Pri mer5.0引物设计软件，设计h TERT引 物 序 列，上 游：CGGAAGAGTGTCTGGAGCAA， 下 游：GGATGAAGCGGAGTCTGGA，145bp。按照试剂盒说明，提取总RNA，进行c DNA的合成及PCR扩增。将扩增产物各5μl，行1.0%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶分析系统分析图像，计算目的基因与内参照（β-actin）扩增带灰度值之比，即得目的基因mRNA的相对表达量。

3.统计学分析

结果用均数±标准差（¯x±s）表示，采用SPSS17.0统计软件对结果进行分析，数据采用两组均数的t检验，检验水准α＝0.05。

结 果

1.形态学异质性

培养在软琼脂中的Hep G2细胞呈圆形透亮，第2d时多数细胞仍然散在，少数已形成由4-6个细胞组成的集落；第10d时出现肉眼可见的集落。分离克隆形成细胞，传代培养。HE染色显示，克隆形成细胞的胞核较Hep G2细胞大，核仁明显（图1）。与Hep G2细胞相比，克隆形成细胞伸出较多的细长突起，这些突起呈管状，可相互连接形成网状。

2.h TERT表达的异质性

免疫细胞化学染色显示，h TERT在Hep G2细胞和克隆形成细胞中均有表达，其在Hep G2细胞的表达以细胞质为主，细胞核中表达较少；而克隆形成细胞则以细胞核为主（图1）。Wester n blotting结果显示，克隆形成细胞中h TERT的表达高于Hep G2细胞（图2）。RT-PCR结果显示，h TERT mRNA在Hep G2细胞和克隆形成细胞都有表达，且克隆形成细胞的表达量较高（图3）。

图2 Wetern Blot显示h TERT在Hep G2细胞及其克隆形成细胞中的表达A：Hep G2细胞；B：克隆形成细胞（P＊＜0.05）图3 RT-PCR显示h TERT mRNA在Hep G2及其克隆形成细胞中的表达A：Hep G2细胞；B：克隆形成细胞 （P＊＜0.05）Fig.2 Expression of h TERT in Hep G2 cells and its colony-for ming cells A：Hep G2 cells；B：colony-for ming cells（P＊ ＜0.05）Fig.3 Expression of h TERT mRNA in Hep G2 cells and its colony-f or ming cells A：Hep G2 cells；B：colony-f or ming cells（P＊＜0.05）

讨 论

端粒是真核细胞染色体末端的DNA重复序列和特异结合蛋白的复合体，众多报道都表明恶性瘤组织与良性瘤和正常组织的端粒酶检出率有极显著差别。Takaishi等［7］用定量端粒酶检测法对原发性肝癌发生发展不同阶段的端粒酶活性表达情况进行了研究，结果发现端粒酶相对活性平均值在非癌肝组织（包括慢性肝病和正常肝组织）为0.4，癌前结节为8.5，分化良好的肝细胞肝癌 HCC为87，分化中度的HCC为265，分化差的HCC为447。端粒酶活性的表达随肝癌的发生发展而升高，并与其分化程度密切相关。Tahara等［8］报道，原发性肝癌（HCC）组织端粒酶阳性率为85%。在急、慢性肝炎和肝硬化组织中未见高、中活性表达，但55%呈低活性表达而正常肝组织均无端粒酶表达。病理学观察发现，HCC端粒酶活性表达与细胞分化呈显著正相关，中、低分化的肝癌组织端粒酶呈高水平表达，高分化肝癌呈低水平表达。Shay等［9］总结了不同学者对人类肿瘤端粒酶探讨的检测结果，发现正常组织（196例），癌旁组织（690例）、原位癌（410例）和恶性肿瘤（2031例）的端粒酶的阳性率，它们分别是0.5%、11%、30%、和85%。在前列腺、乳腺、胰腺、肺、肝的早期癌中端粒酶的阳性率为85.0%-95.0%，而对应的癌旁或良性病变组织中，端粒酶基本上不能检出或活性极微弱。另有研究表明，端粒酶在胃癌、乳腺癌、肺癌及结肠癌等多种恶性肿瘤中的表达均显著高于其相应的癌旁组织，提示端粒酶活性的高低可以反映细胞的增殖能力，是肿瘤诊断和分型的标志物，与肿瘤的发生发展密切相关。

h TRET是端粒酶活性的限速酶，与端粒酶的活性密切相关［10，11］。在体外实验中将h TERT转录翻译后再与h TR重组，结果表现出端粒酶活性，而改变h TERT中氨基酸后，端粒酶活性减低或消失［12］，将h TERT导入人体正常细胞，端粒酶活性被诱导激活［13］，表明h TERT的表达水平与端粒酶活性直接相关［14，15］。

实验结果显示，克隆形成细胞的体积较大，核仁明显，这可能与克隆形成细胞分裂快有关。免疫细胞 化 学、Wester n blotting 及 RT-PCR 均 显 示h TERT的表达高于Hep G2细胞，并出现核移位，推测可能与h TERT的生物学作用有关。h TERT在胞质合成，在核内发挥作用，因此它的核移位是其活性调节的重要机制。在非活化状态下h TERT存在于胞质，由于磷酸化或其他机制导致h TERT发生核移位。说明h TERT在克隆形成细胞中处于活化状态的较多。

总之，本研究利用软琼脂克隆形成实验成功分离出了克隆形成细胞，通过HE染色和免疫细胞化学染色观察了Hep G2细胞的形态异质性；用Wester n blotting、RT-PCR 检测了 h TERT 表达的异质性，提示克隆形成细胞具有肝癌干细胞的特征，支持肝癌干细胞的理论。

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Heterogeneity of telomerase activation in Hep G2 and its colony-f or ming cells

Yu Shuna，Wang Baosong，Jiang Hongxin1，Shi Caixing，Zheng Jie2，Jiang Jiying＊
（Depart ment of Anato my，Weif ang Medical college；1Mor phol ogy Lab，Weif ang Medical college；2Depart ment of Pathology，Weif ang Medical college，Shandong 261053，China）

Objective To ill ustrate t he heter ogeneity of telo merase in cells wit h different repr oductive activity and to pr ovide a new tar get f or diagnosis and treat ment of hepato ma，we st udied t he expression of telo merase in Hep G2 and its colony-for ming cells.Methods The soft agar clone f or mation experi ment was adopted to separate t he colony-f or ming cells fr o m Hep G2 cells.Hep G2 cells and its colony-f or ming cells were cultured.Then i mmunocytochemistry，wester n blotting and RT-PCR were used to examine the expressions of h TERT in Hep G2 and its col ony-f or ming cells，respectively.Results ① Co mpared with Hep G2 cells，t he col ony-f or ming cells had a characteristic of lar ger nuclei，pr o minent nucleoli and more cell processes.②Immunocytochemistry showed that the expression of h TERT protein was mainly located in t he cytoplas m of Hep G2 and in t he nuclei of colony-f or ming cells.③ Wester n bl otting and RT-PCR showed that the expressions of h TERT protein and mRNA in the clone-for ming cells were higher than those in Hep G2 cells，respectively.Concl usion① The expression of h TERT in Hep G2 cells and its colony f or ming cells is heter ogeneous，and t he expression of h TERT in t he colony f or ming cells is higher t han that in Hep G2 cells.② The expression patter ns of h TERT in Hep G2 and its colony-f or ming cells i mply t hat t he col ony-f or ming cells have t he characteristics of liver cancer ste m cells.

Liver cancer；h TERT；Heterogeneity；Tu mor ste m cell

R735.7

A

10.3870／zgzzhx.2012.04.009

2012-01-13

2012-05-21

山东省“泰山学者”建设工程专项经费；山东省教育厅资助项目（J07 WE27）

于树娜，女（1979年），汉族，硕士研究生。

＊通讯作者（To who m correspondence should be addressed）