牙周组织再生技术的研究进展

高丽娜 综述;陈发明，金 岩 审校

(第四军医大学口腔医学院，陕西西安710032)

牙周炎是引起成年人牙齿丧失的主要原因之一，也是危害人类口腔和全身健康的主要口腔疾病，因此牙周炎的预防和治疗越来越引起学者们的重视。目前牙周炎临床治疗方法主要包括龈上洁治、龈下刮治、根面平整、牙周手术等，其目的是去除感染、阻止病变进程，但难以使已丧失的牙周组织获得良好再生，临床修复往往以长结合方式，即牙龈上皮组织沿牙根面生长，这种修复虽恢复了组织的连续性，但并未真正恢复牙周组织的结构和功能。牙周组织再生的最终目的是实现牙槽骨、牙骨质以及锚定在二者之间的牙周膜的再生与功能重建。本文就近年来牙周组织再生技术的进展作一综述。

1 传统的牙周组织再生

为了克服长结合上皮的发生和修复缺损的牙槽骨，再生医学技术中骨移植术、引导组织再生术以及两者的结合为牙周组织的再生带来了希望。目前已广泛的应用于临床牙周手术中。植骨术是指用骨和骨替代品植入牙周骨缺损部位，通过促进新骨的形成来修复骨缺损，恢复牙槽骨的解剖形态，以达到牙周组织再生和新附着形成的手术方法。该技术主要是利用植骨材料的骨发生、骨诱导、骨引导性发挥作用［1－2］。引导组织再生术是在牙周手术中利用膜性材料的物理屏障作用，阻止生长较快的结缔组织、牙龈上皮细胞进入缺损区并保持一定的组织生存空间，引导牙周膜细胞优先占领根面，从而为牙周组织的修复再生提供时间和空间［3－4］。继引导组织再生术后，生长因子，釉基质衍生物的使用虽一定程度上加速了牙周组织再生的进程［5－6］，但多年的临床应用发现这些技术的再生能力有限，再生组织仅仅局限在牙周缺损的底部，并且在很大程度上受缺损形式和剩余组织量的影响。

2 干细胞介导的组织再生

干细胞和再生医学是近年来方兴未艾的生物医学新领域，其旨在通过干细胞移植、分化和组织再生，促进机体创伤修复、治疗疾病。干细胞移植是否有效，能否实现向临床转化取决于移植细胞的来源和功能、移植到体内的细胞能否准确定位、移植细胞的存活数量以及与周围组织的整合程度。不同移植方式移植的细胞其体内发挥效果也不同。目前细胞移植方式主要有支架承载型和无支架型。其中支架承载型多见于组织工程，无支架型主要包括单细胞悬液注射，以及近些年来发展的细胞膜片技术。

2.1 单细胞悬液注射

传统的干细胞移植主要通过注射骨髓细胞来治疗一些致死性［7－10］或非致死性疾病如严重肝衰竭［11］、神经系统疾病［12］、周围缺血性疾病等。最近临床上通过将骨髓细胞和骨骼肌细胞直接注射到缺血心肌来进行组织特异性功能修复，避免了整个器官的移植［13－14］。这种将单细胞悬液直接或间接注射到组织病损区的方法具有操作简便、创伤小、适合治疗各种疾病。但由于细胞悬液的流动性、注射后细胞容易丢失、不能准确定位、不利于细胞与病损部位结合，导致发挥作用的细胞量很少;另外，细胞注射液不能提供一定的机械支持力、容易迁移进入毛细血管从而可能导致毛细血管栓塞，影响局部血供。最重要的是:这种方法促进牙周组织再生的能力有限，不能达到牙周组织的完全再生。Mcgire等［15］将自体牙龈成纤维细胞多次注射到预处理的牙龈乳头处，以期恢复其高度，他们发现这种方法虽然安全，但只在组织愈合的前2个月有较明显效果，且不能完全恢复至初始高度。

2.2 牙周组织工程技术

牙周组织工程主要包括三个因素:种子细胞、生长因子和生物支架。通过将体外培养的高浓度、功能相关的活细胞种植于具有良好生物相容性和生物降解性的细胞外基质材料上，在生长因子的作用下，经过一段时间的培养后，再将这种细胞和生物材料复合体植入牙周病损部位，以形成新的具有其原来特殊功能和形态的相应牙周组织，达到修复创伤和重建功能的目的［16－17］。鲁红等［18］报道:体外培养的动物自体牙周膜细胞(PDLCs)能在纳米羟基磷灰石(nHAC)材料三维支架上牢固贴附并生长旺盛，将PDLCs－nHAC植入动物体内，与对照组相比有更多的新生牙槽骨、新生牙周膜和新生牙骨质生成，缺损处牙周组织几乎完全再生 ，且未见上皮长入。由此可见:牙周组织工程在很大程度上促进了组织再生量，但也存在一些不足之处，如:①种子细胞来源和体内分化问题，这些研究大多数是三维基质上接种单一类型细胞后移植到组织缺损处，还没有一个研究得到期望的组织重建，可能是由于细胞来源的选择困难以及很难控制细胞在局部的分化;②生长因子的作用机制不完全了解以及缓、控释问题;③支架材料可能引起的局部炎症反应影响再生微环境等问题。

真正的牙周组织再生是结构和功能完整的再生，两种硬组织(牙骨质、牙槽骨)和软组织(牙周膜)的再生是通过前体细胞和生长因子相互作用而发生的并有一定的时间差。因此要求移植细胞和生长因子在牙周组织再生中必须精确。换句话说，并不是仅仅通过移植单一类型的细胞到缺损处进行空间维护和在生物体内进行组织分化，而需要通过细胞外基质中各种生长因子与细胞相互作用来调节细胞的行为，使细胞到达相应位点发挥相应功能来促进组织再生。

2.3 细胞膜片技术

细胞膜片技术(cell sheet engineering)是近年来发展较快的一项组织工程学技术，它是采用非酶解的方式获取种子细胞，以膜片中细胞自身分泌的细胞外基质作为载体，从而使细胞之间的连接蛋白和细胞外基质能够被完整地保存，避免了使用酶消化法对细胞的生物学功能如离子通道、细胞因子感受器和细胞因子受体等造成损伤。同时细胞膜片上保留的粘附蛋白能更好地促进细胞粘附到组织上而不需要缝合。除此之外，细胞膜片还具有可塑性，不受缺损形态的影响;而且不需要支架材料，避免了支架材料降解成分对组织细胞的危害。目前该技术已大量应用于皮肤、角膜、心脏和骨组织等再生医学的研究，其中角膜缘上皮细胞和自体口腔黏膜细胞膜片已成功应用于临床［19］。

2.3.1 细胞膜片的制备方法

牙周膜细胞膜片技术的制备方法有酶溶解法、外科切取法和温度敏感式培养法。Nagai N［20］(2004)将牙周膜细胞培养于鲑鱼不全胶原上，采用胶原酶溶解法获取了结构较为完整的牙周膜细胞膜片。该方法对细胞的活性不存在负面影响，便于完整获取大面积的单层细胞膜片。但是酶可降解细胞外基质中的纤维结合素和整合素，可降低膜片的粘附力或致膜片的收缩。有报道称:维生素C可以促进细胞外基质的分泌［21］，通过含有维生素C的培养基连续培养数周而获得的细胞膜片，由于其具有一定的韧性，可以用细胞刮将其机械刮下。这样不但不会破坏细胞之间的ECM和相关蛋白，同时可以避免由于胰酶消化而导致的细胞活性的丢失，但对于较大面积膜片的操作较为困难。温度敏感式培养［22］法是利用聚异丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)具有温度响应(即以32℃为界，在疏水性－亲水性间可逆变化)的特性，将PNIPAAm以共价键形式固定在TCPs表面进行细胞培养，然后通过其温度响应性，使整体细胞群在保持细胞间连接状态下以片状形态得以脱附。与传统酶解方法相比，温度敏感式培养法获得的细胞膜片可以最大限度地维持细胞间的正常连接，保持细胞外基质的完整性，而且还具有完整的对胰酶－EDTA敏感的整合素。

外科剥离和温度感应式培养技术是目前较为常用的膜片制备技术，它可以最大限度地保存膜片内的细胞外基质和各种信号因子，并保存细胞－细胞外基质间的三维连接。

2.3.2 细胞膜片技术在牙周组织再生中的应用研究

目前细胞膜片技术已经成为公认的方式应用于角膜上皮、食管上皮、气管上皮、肝、皮肤、心肌组织等组织的再生，最近细胞膜片工程又作为新手段开始应用于牙周组织再生。Hasegawa等［23］用含维生素C的基础培养基连续培养人PDLCs 3周后形成细胞膜片，移植到免疫缺陷大鼠牙槽骨开裂模型的牙周组织缺损处，结果发现:实验组在牙周组织缺损区域形成类似正常牙周膜的结构，包括有胶原纤维插入的无细胞牙骨质;而空白对照组则无类似的结构形成，新生骨直接与根面接触发生牙本质－骨粘连或出现根面吸收。该实验提示:牙周膜细胞膜片具有再生牙周组织的能力。

牙周组织是由软、硬组织共同组成的一个结构复杂的功能系统，采用组织工程进行牙周组织重建时，移植的细胞必须同时具备修复结缔组织和矿化组织的能力。为了提高PDLCs膜片的矿化潜能，Flores等［24］(2008)用含有成骨诱导液的培养基诱导形成PDLSCs膜片，将其与牙本质块复合移植到免疫缺陷鼠背部皮下，形成了不成熟的牙骨质和牙周膜结构;而仅通过基础培养基培养获得的PDLSCs膜片(对照组)却没有观察到类似结构。随后Flores［25］又将经不同诱导培养的人牙周膜细胞膜片应用于无胸腺大鼠牙周穿通性缺损的修复，结果显示矿化诱导组大多数样本观察到新生牙骨质层和胶原纤维的附着;而对照组虽有密集的细胞外基质和纤维形成，但牙骨质再生率显著低于实验组。

与其他细胞移植方式相比，细胞膜片技术虽可避免酶消化过程对各种膜相关蛋白的水解，但细胞膜片的强度还不足以实际应用。为加强牙周膜细胞膜片的强度，Akizuki等［26］将Beagle犬的自体牙周膜细胞在含有维生素C的基础培养液连续培养2周获得牙周膜细胞层片，再用强化透明质酸膜作为载体回植到Beagle犬下颌双侧第一磨牙近中牙根颊面牙周缺损区，术后8周，实验组3个术区观察到有骨组织、牙周韧带和牙骨质形成，显著高于仅用强化透明质酸膜的对照组。Iwata［27］(2009)通过自体移植的方式在三壁骨缺损的牙根表面植入聚乙醇酸(PGA)支撑的三层牙周膜干细胞膜片，并用多孔β－磷酸三钙充填骨缺损区，结果显示:细胞膜片移植组再生出了新骨、牙骨质以及连接二者排列整齐的胶原纤维，而没有进行细胞膜片移植的对照组只观察到有限的骨再生。

对于复杂组织再生，关键是创造一个近似天然的微环境，以控制细胞的增殖、迁移和分化。杨振华［28］(2009)模拟牙根－牙周发育的微环境，利用根端牙胚细胞条件培养液APTG－CM成功诱导形成PDLSCs细胞膜片，并利用膜片体外容易聚合成团的特性建立高密度细胞聚合体的三维立体培养体系;最后对具备一定强度和厚度的不同类型细胞聚合体进行体外修整、塑形和叠加后分别复合到陶瓷牛骨(CBB)和牙本质片上移植到裸鼠皮下，结果显示:移植6周形成了类牙周膜样结构。牙囊是在牙周组织发育早期通过上皮细胞层从正在发育的牙本质中分离出来的，在牙发育过程中起关键作用。近年来，大量的体内、体外研究证实:牙囊来源的细胞具有分化为牙周组织形成细胞(牙周成纤维细胞、成牙骨质细胞和成骨细胞)的能力［29］。Handa等［30］将分离培养的牛牙囊细胞与羟基磷灰石复合，植入裸鼠体内，4周即发现在羟基磷灰石表面有牙骨质样结构形成。Bai Yudi等［31］用上皮根鞘细胞(HERS)与牙囊细胞(DFC)共同培养1周后，I型胶原(col－1)、ALP、runt相关转录因子2 (Runx2)、骨涎蛋白(BSP)等在mRNA水平均明显提高;培养3周后，ALP、OCN、BSP、OPG表达阳性的DFCs细胞数量增多，DFCs也产生了更多的钙化结节。作者又将HERS诱导3周后的DFC形成细胞膜片并移植到雄性大鼠网膜下，5周后发现有牙骨质样组织和牙周韧带样组织形成;而未经HERS诱导的DFC膜片(对照组)仅产生了纤维组织。该实验表明:经HERS诱导后DFC细胞膜片可通过上皮－间充质相互作用而产生牙周组织。

目前通过细胞膜片技术构建组织主要有三种方式:一是单层细胞膜片直接移植到宿主体内，如皮肤［32］、角膜上皮［33］、膀胱尿路上皮［34］、牙周韧带组织［35］等;二是应用同型细胞膜片多层复合来重建组织三维结构，如心肌组织［36］、平滑肌组织［37－38］;三是通过不同类型细胞膜片的多层复合来构建更加复杂的层状组织结构，如肝小叶［16］、肾小球。对于牙周组织，目前已证明基于单细胞类型的再生能力有限，多种细胞复合的细胞膜片可获得满意的结果。谢函等［39］将利用Transwell共培养系统获得的人髂骨骨髓间充质干细胞(BMMSCs)和人牙周膜干细胞(PDLSCs)的混合膜片形成细胞团块后与煅烧陶瓷牛骨复合移植到裸鼠皮下，结果显示:再生出了带有血管化的牙骨质－牙周膜样组织。该结果提示，混合的细胞膜片(团块)能模拟牙周再生的微环境，从而达到生理学意义上的牙骨质－牙周膜样组织的再生。

3 牙周组织再生的发展和展望

3.1 干细胞的异体应用

牙周膜干细胞被认为是牙周组织再生的最佳种子细胞来源，但牙周病的病人大多数是中老年人，牙周膜干细胞十分有限，且细胞体外培养时间很长，极大影响了牙周再生技术的开展。如果干细胞能异体应用，通过建立细胞库就可以扩大牙周再生种子细胞的来源，极大推进牙周组织再生的发展，加快牙周组织再生技术向临床的转化。要解决牙周膜干细胞的异体应用，首先要研究牙周膜干细胞的免疫学特性，最近有学者［40］建立了一个新的方式，即将同种异体牙周膜干细胞膜片用于小型猪牙周炎模型中，结果显示，移植12周后，自体牙周膜干细胞膜片组和同种异体牙周膜干细胞膜片组均表现出明显的牙周组织再生，并且同种异体细胞移植在动物体内并没有发生免疫反应。该研究证明了牙周膜干细胞具有低免疫原性。

3.2 提高细胞膜片的生物学性能和可操作性

细胞膜片是由细胞与自身分泌的细胞外基质组成，移植到体内后易于适应环境，能较长时间保持细胞活性，且细胞的生长方式类似于组织块法，细胞沿边缘爬出。因此将细胞膜片适时引入到牙周组织工程将是今后牙周组织再生、重建可供选择的方案之一。但这样的结构也决定了细胞膜片容易挛缩的特征，尤其是具有较强收缩能力的纤维细胞膜片在无外源性载体的支持下会因细胞外基质结构和细胞骨架的收缩而出现挛缩，但外源性载体的应用可能会干扰组织的代谢和改建，且过度刺激细胞外基质的分泌而对膜片的结构和功能造成不利的影响，因此应当深入探讨细胞和细胞外基质的生物学机制以及优化膜片制备的方式，充分保证有效的膜片强度并避免种子细胞的不利分化。另外，还应综合牙周再生的影响因素，系统地掌握不同的牙周缺损修复和组织再生对移植细胞的量效关系、移植时间以及移植途径的需求，并通过建立先进的高解析度、非侵入式成像技术实时地评估组织再生的生理和功能疗效。

3.3 微环境的调控

所谓的“微环境”，就是由细胞、生长因子和细胞外基质(extracellular matrix，ECM)共同构成的动态环境，它是细胞在体内赖以生存的局部条件，控制着细胞的增殖、分化。为了能更好的保障移植细胞的量和细胞的活性，应当通过调控局部微环境，使移植膜片内的细胞能在植床内尽早而有效的附着、生长和转化;通过物理、化学、生物刺激和调节膜片与受体组织相融合，尽早发挥功能，促进牙周组织再生。另一方面，目前对于牙周膜干细胞膜片在牙周再生中的研究多采用急性牙周缺损模型来评价，因干扰因素较少，能够较为充分地证实牙周膜干细胞和细胞膜片的再生机制，但急性牙周缺损模型不能代表复杂的慢性牙周炎状况，慢性牙周炎症对牙周组织的影响是全方面的，包括牙周膜细胞、牙周韧带、牙根面、牙周的生物力学性能等，因此应当进一步探讨种子细胞与牙周微环境的相互作用，有针对性地改善各种不利的微环境因素对种子细胞的影响以促进真正意义上的功能性牙周组织重建。

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