Ⅰ型胶原酶对人牙周膜胶原蛋白构象影响的拉曼光谱研究

刘 懋，唐苗宁，管佳妮，谢理哲，吴 斌，顾敏芬，严 斌

牙周膜是连接牙根与牙槽骨的致密结缔组织，厚度为0.15～0.38 mm，具有承载和传导力、调节和缓冲咀嚼压力的作用。牙周膜的组成成分包含胶原纤维、非弹性纤维、基质、细胞等[1]，其中，胶原纤维包括多种分型，以Ⅰ型胶原含量最多，占牙周膜的78.06%[2]，主要由胶原蛋白构成，能够抵抗牵拉力。牙周膜在正畸力刺激下的生物力学响应，对牙槽骨的改建起调控作用。牙周膜中胶原蛋白的合成与降解，在正畸牙移动过程中起着重要作用[3]。

Ⅰ型胶原纤维构成了牙周膜的主体，其主要成分为胶原蛋白。胶原蛋白是结缔组织中的一种结构性蛋白质，具有多样的分子构象，胶原分子的有序排列使胶原纤维具有一定的强度和韧性[4]。以往对于牙周膜胶原的生物力学研究，主要集中于力刺激对胶原蛋白表达的影响， Xu等[5]在大鼠正畸牙移动模型中，通过免疫组化染色和Western blot的方法发现牙周膜张力侧Ⅰ型和Ⅲ型胶原的表达上调。Komatsu等[6]探究了胶原的机械性破坏对力学响应的影响，通过使用Ⅲ型胶原酶处理大鼠牙周膜，观察到牙周膜纤维的形态学改变，同时力学实验中最大剪切力减小。KarisAllen等[7]发现高温会使胶原蛋白受到机械性损伤，破坏纤维交联，从而出现胶原纤维密度改变。然而，现有的研究主要以胶原含量的表征为主，而胶原蛋白本身复杂的空间构象对蛋白质功能有重要作用[8]，目前，在分子水平上，牙周膜胶原蛋白的空间结构改变如何影响牙周膜特性仍未被阐明。

近年来，拉曼光谱技术被广泛应用于生物医学材料的检测[9]，具有对多种功能基团敏感、高特异性、无损的特点。在口腔黏膜病、牙周炎、口腔癌的诊断上也开展了临床研究[10]，通过检测组织样本的分子结构改变，为早期诊断口腔疾病提供了可能。但是，由于牙周膜材料尺寸较小，并且难以完整获取，故以往拉曼光谱较少应用于牙周膜研究[11]。共聚焦显微拉曼光谱结合激光共聚焦显微镜，提高了检测精确度，同时不受样本保湿条件的影响，故适用于研究微小的牙周膜胶原改性的结构变化。

本文以人牙周膜样本为研究对象，针对牙周膜中含量最丰富的Ⅰ型胶原，通过Ⅰ型胶原酶处理模拟胶原降解，进行显微拉曼光谱检测，分析牙周膜胶原改性后胶原蛋白结构的变化，为深入研究牙周膜的生物力学特性提供新的思路和依据。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料和仪器

健康人上颌骨1个[南京医科大学伦审(2019)324号]。Ⅰ型胶原酶(Sigma，美国)。

低速切割机(500 r/s,IsoMet，Buehler，美国)，金刚石刀片(φ100 mm×φ12.7 mm×0.4 mm,科晶，中国)。激光共聚焦显微拉曼光谱仪(LabRAM HR Evolution，HORIBA，法国)。

拉曼光谱分析软件Labspec(version 6，HORIBA，法国)；光谱分峰拟合软件Peakfit(version 4.12，Seasolve，美国);图表绘制分析软件Origin(version 2018, origin-lab，美国)。

1.2 样本制备

将人上颌骨颊腭侧黏膜组织剥离，利用手工锯分离获得包括2颗上颌前磨牙的块状牙齿组织。使用低速切割机将切下的块状样本沿垂直于牙齿长轴的方向自牙槽嵴顶至根尖段，切割成2 mm厚的薄片各3片。

每一薄片再使用低速切割机进行样本的制备。使用金刚石刀片垂直于牙薄片，沿牙中心部位将样本分割为4条均包含“牙齿-牙周膜-牙槽骨”的三明治长条状样本(图1A)。将制备好的样本放入装有生理盐水溶液的试管中并置于-20 ℃冰箱保存。

1.3 样本分组

选取牙根中部的样本，将同一牙位的近中、远中两条长条样本随机划分进胶原酶处理组和对照组，每组包含3个样本。

1.4 胶原酶处理

Ⅰ型胶原酶溶液配制：将Ⅰ型胶原酶溶解于缓冲液，制成10 mg/mL[12]的胶原酶溶液。

将酶处理组的牙周膜样本放入37 ℃水浴锅化冻，PBS冲洗样本后，置入Ⅰ型胶原酶溶液浸泡2 h，取出样本，置入PBS溶液浸泡3次，每次10 min。最后将样本放回含生理盐水试管中-20 ℃保存。

1.5 拉曼光谱检测

实验当天将处理组和对照组的样本均提前化冻，6个样本依次使用激光共聚焦显微拉曼光谱仪(图1B)进行检测。参考Perillo[11]的方法设定参数，仪器的激发波长为633 nm，放大倍数50倍，积分时间为30 s，光谱范围200～2 000 cm-1，累计3次。

A：牙周膜样本 B：拉曼光谱仪

1.6 数据处理

实验获得人牙周膜样本拉曼光谱曲线，通过拉曼光谱分析软件Labspec 6 进行基线校正，用Peakfit软件(v4.12)对样本光谱酰胺Ⅰ带和酰胺Ⅲ带进行高斯拟合，得到图谱的特征峰强度和峰面积，求得胶原蛋白二级结构各组分的相对百分比含量，使用图像绘制软件Origin (2018版本)进行曲线图绘制。

2 结 果

2.1 牙周膜拉曼光谱曲线

如图2所示，牙周膜的拉曼光谱特征峰主要包括： 853 cm-1处的酪氨酸，935 cm-1处的C—C伸缩振动，1 005 cm-1处的苯丙氨酸，1 459 cm-1处的CH2， 1 200～1 350 cm-1的酰胺Ⅲ带，1 600～1 700 cm-1的酰胺Ⅰ带。胶原酶处理组和对照组的牙周膜的显微拉曼光谱图展现在图2中,主链的酰胺Ⅰ带和酰胺Ⅲ带的谱峰强度在胶原酶处理组和对照组不同，表明蛋白质主链构象的二级结构发生变化。

图2 Ⅰ型胶原酶处理组和对照组的牙周膜样本显微拉曼光谱Fig.2 Micro-Raman spectra of periodontal ligament samples in control group and collagenase Ⅰ treatment group

2.2 酰胺Ⅲ带的高斯拟合图谱分析

对各组牙周膜样本的拉曼图谱在1 200～1 350 cm-1范围的酰胺Ⅲ带进行分峰,得到子峰的谱线，并进行高斯拟合(图3)。图中表明，在正常组牙周膜样本中，酰胺Ⅲ带可见4根谱线，分别在1 239 cm-1(β-折叠)，1 252 cm-1(无规卷曲),1 272 cm-1(α-螺旋),1 289 cm-1(β-回折)。在胶原酶处理后，4根谱线的峰高均减小，峰位出现了偏移(表1)，分别对应α-螺旋、β-折叠、β-回折结构发生了向右的红移，无规卷曲发生了向左的紫移。

根据特征峰位使用Peakfit软件进行高斯拟合，获得各子峰的峰面积，以各峰面积占总面积的百分比值作为各二级结构的相对含量(表2)。正常牙周膜中，酰胺Ⅲ带各二级结构的含量如表2所示，α-螺旋结构的相对含量最大，占61%，其余结构的相对含量由大到小依次为：无规卷曲、β-折叠，β-回折。通过胶原酶的降解，α-螺旋结构的含量降低，由61%下降到9%，无规卷曲和β-折叠、β-回折的相对含量增加，可能是胶原蛋白二级结构发生了转化[13]。

A：酶处理组；B：对照组

表1 胶原酶处理组和对照组胶原蛋白二级结构光谱带归属Tab.1 Spectral band assignment of collagen secondary structure in control group and collagenase Ⅰ treatment group

2.3 酰胺Ⅰ带的高斯拟合图谱分析

图2表明，牙周膜胶原蛋白酰胺Ⅰ带分布在1 600～1 700 cm-1范围，进行分峰得到4根二级结构谱线(图4)。与正常牙周膜相比，经过胶原酶降解的牙周膜样本的α-螺旋、310-螺旋的相对含量增加，β-折叠的比值有所减小，β-回折的比值基本不变。此外，各结构的峰中心也出现了偏移(表1)。

表2 胶原酶处理组和对照组酰胺Ⅲ带二级结构含量百分比Tab.2 The percentage of secondary structure of amide Ⅲ band in control group and collagenase Ⅰ treatment group

A：酶处理组；B：对照组

3 讨 论

本研究使用拉曼光谱仪对牙周膜胶原蛋白的功能基团精准检测，从分子层面探究胶原蛋白构象的变化。实验获得了牙周膜的拉曼光谱图，发现胶原蛋白的特征峰主要集中在酰胺Ⅰ带、酰胺Ⅲ带、CH2以及C—C键伸缩振动，这与Perillo的研究结果基本一致[11]，除此之外研究发现酪氨酸和苯丙氨酸也显示了特征性的吸收峰。证明显微拉曼检测可应用于牙周膜微观构象的研究。

牙周膜由多种胶原组成，其中主要是Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅴ型胶原，分别占75%[14]～78.06%[2]、20%、5%[15]。Ⅰ型胶原是结缔组织中结构蛋白的一种，广泛存在于皮肤、韧带等，是组织代谢和力学性能的结构基础，在牙周膜成分中的含量最多，构成了Ⅰ型胶原纤维。以往研究表明， 牙周膜Ⅰ型胶原的基因表达随着牙周膜细胞的机械负载而改变[16-18]，在张力侧、高咬合力处胶原表达增加。胶原蛋白的分子结构可分为四级，其含量和排列决定了蛋白质的生物学活性。崔素萍等[19]发现，蛋白的二级结构会对蛋白质功能产生影响。蛋白二级结构指主链原子的空间构象，主要包括：α-螺旋、β-折叠、β-回折、无规卷曲。其中，α-螺旋的肽链上所有的肽键都参与氢键的形成，具有相当的稳定性，与牙周膜的弹性性能有关[11]。在本研究中，胶原蛋白在处理前后的拉曼光谱图在酰胺Ⅰ带和酰胺Ⅲ带发生变化。在酰胺Ⅲ带中，α-螺旋的相对含量减少，而β-回折、β-折叠和无规卷曲的含量增加。这说明胶原酶降解后，可能发生了二级结构的互相转化，并表现为胶原蛋白的结构和性能的改变，α-螺旋维持结构稳定的链内氢键可能被破坏[20]。在酰胺Ⅰ带中，α-螺旋的相对含量增加，β-折叠的相对含量减小，这表明牙周膜在胶原酶处理后，蛋白的二级结构改变，破坏了蛋白的稳定性，可能影响牙周膜的生物力学性能[21]。

Ⅰ型胶原酶在生理条件下能够特异性地水解Ⅰ型胶原蛋白的空间结构，而不损伤其他蛋白质和组织[22]。因此，本实验特异性研究了Ⅰ型胶原蛋白结构的变化。但是，胶原酶本身也是一种蛋白质，不能忽略Ⅰ型胶原酶本身在拉曼检测中对实验结果的影响，在样本处理时需使用PBS缓冲液反复冲洗样本以去除样本表面的胶原酶残留。

胶原纤维的降解出现在正畸治疗或牙周洁治后牙龈炎症缓解时[23-24]。在正畸治疗中，患有严重牙周炎的错牙合畸形患者的牙齿移动速率较正常减慢，这可能与牙周膜胶原结构被破坏有关[25-26]。但是本研究仅探究了牙周膜样本的蛋白结构改变，在未来研究中，应当考虑与力学实验相结合，以进一步定性定量探究蛋白结构对牙周膜特性的影响。

4 结 论

本文通过显微拉曼光谱检测初步探究了人前磨牙牙周膜在Ⅰ型胶原酶处理后胶原蛋白的微观结构和构象的变化，证明拉曼光谱应用于牙周膜样本的可行性。实验获得了人牙周膜的拉曼光谱图的特征峰，发现胶原酶处理后牙周膜胶原蛋白在酰胺Ⅲ带和酰胺Ⅰ带二级结构光谱图的特征峰位和峰面积改变，在酰胺Ⅲ带的二级结构相对含量的比值改变，提示牙周膜胶原降解后胶原蛋白结构的稳定性被破坏，可能会降低牙周膜的力学性能，为进一步研究牙周膜生物力学特性提供参考。