2-甲氧基雌二醇对4T1、SPC-A1和PC-3细胞的生长抑制作用
2012-12-07王文佳张正全李雪冰张振中
王文佳,张正全,贾 欣,李雪冰,张振中
郑州大学药学院郑州 450001
#通讯作者,女,1975年8月生,硕士,讲师,研究方向:肿瘤靶向药物治疗,E-mail:jiaxin@zzu.edu.cn
2-甲氧基雌二醇对4T1、SPC-A1和PC-3细胞的生长抑制作用
王文佳,张正全,贾 欣#,李雪冰,张振中
郑州大学药学院郑州 450001
#通讯作者,女,1975年8月生,硕士,讲师,研究方向:肿瘤靶向药物治疗,E-mail:jiaxin@zzu.edu.cn
2-甲氧基雌二醇;维拉帕米;协同指数;4T1;SPC-A1细胞;PC-3细胞
目的:探讨2-甲氧基雌二醇(2-ME)对多种肿瘤细胞的生长抑制作用。方法:以鼠乳癌4T1细胞株、人肺腺癌SPC-A1细胞株、人前列腺癌PC-3细胞株为研究对象,采用SRB法考察2-ME对多种肿瘤细胞的生长抑制作用,并联合维拉帕米,利用协同指数探讨影响2-ME抗癌作用的因素。结果:2-ME对4T1、SPC-A1和PC-3细胞有不同程度的抑制作用,IC50分别是6.11、1.89和5.12 μmol/L;联合维拉帕米后,抑制率高于单独用药组(P<0.01),IC50分别降低至2.01、0.57和2.77 μmol/L,协同指数0.77~0.43。结论:2-ME对3种细胞都有一定的生长抑制作用,维拉帕米对2-ME有明显的增效作用。
2-甲氧基雌二醇(2-methoxyestradiol,2-ME)具有阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡及抑制血管新生的作用[1],且由于其不良反应小,极具研究价值。乳癌、前列腺癌的致病原因跟雌激素息息相关,作者以鼠乳癌4T1细胞株、人肺腺癌SPC-A1细胞株、人前列腺癌PC-3细胞株为研究对象,采用硫基罗丹明蛋白染料(SRB)法考察2-ME对3种肿瘤细胞的生长抑制作用,并联合维拉帕米,利用协同指数探讨影响2-ME抗癌作用的因素。
1 材料与方法
1.1 细胞株、药品及主要试剂 3种细胞株由中国科学院上海细胞库提供(目录号分别是TCM32、TCHu53、TCHu158)。RPMI 1640、DMEM培养基(HyClone,北京赛默飞世尔生物化学有限公司),胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司),SRB和Tris碱(美国Sigma公司),胰蛋白酶(吉诺生物生物医药技术有限公司)。2-ME(自制,纯度>99.0%)。DMSO等其他试剂均为国产AR级试剂。
1.2 维拉帕米对3种肿瘤细胞的生长抑制作用4T1、SPC-A1和PC-3细胞以每孔5×103mL-1接种于96孔板上,在37℃、体积分数5%CO2饱和湿度培养箱中培养24 h后更换培养液,加入含总质量浓度为100、80、40、20、10、5 mg/L的维拉帕米培养液,每质量浓度设4个复孔。以空白培养基为阴性对照,再入培养箱于相同条件下继续培养72 h,采用SRB法于570 nm波长处测定各孔吸光度值(A值),计算抑制率(%)=(1-A/A0)×100%。A:各药物组吸收值,A0:未加药物(对照组)吸收值。
1.3 2-ME对3种肿瘤细胞的生长抑制作用 同1.2的方法培养3种细胞,24 h后更换培养液,分别加入含浓度为0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、10.0 μmol/L的2-ME,每浓度设4个复孔。以空白培养基为阴性对照,后续实验同1.2。
1.4 增效作用研究 向1.3项实验中2-ME作用的4T1、SPC-A1和PC-31细胞同时加入一定量的维拉帕米,其他方法同1.3项,维拉帕米的质量浓度由1.2项确定。
1.5 各组细胞的形态学观察 倒置显微镜下观察各组细胞生长状态及形态变化特点。
1.6 协同指数(CI)计算 采用Chou-Talalay法,计算公式为:CI=D1/DX1+D2/DX2。DX1和DX2分别指两药单独使用时细胞增殖抑制率达X%时的药物浓度,D1和D2指两药联合使用时细胞增殖抑制率达X%时各自的药物浓度。CI<1.0时表示协同作用,CI=1.0时表示相加作用,而CI>1.0时则表示拮抗作用。
1.7 统计学处理 采用SPSS 13.0进行分析。应用Probit法计算IC50值,并在此基础上选用维拉帕米的质量浓度。应用析因设计的方差分析比较2-ME单用及与维拉帕米联合对4T1、SPC-A1和PC-3细胞生长抑制作用的差异,检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 维拉帕米对3种肿瘤细胞的IC50维拉帕米对 4T1、SPC-A1和 PC-3细胞的 IC50值分别为(49.05±5.4)、(77.90±11.0)和(44.51±3.9) mg/L。后续实验选用联合维拉帕米的质量浓度为非细胞抑制剂量(10.3 mg/L)。
2.2 2-ME单用及与维拉帕米联合对3种肿瘤细胞的IC50见表1。加入维拉帕米后,2-ME对3种细胞的IC50下降,增敏倍数分别是3.01、3.32和1.85。
表12 -ME单用及与维拉帕米联合对3种细胞的IC50 μmol/L
2.32-ME单用及与维拉帕米联合对4T1、SPC-A1和PC-3细胞生长的抑制作用 见表2~4。由表2~4可知,不同剂量的2-ME对3种细胞的抑制率不同,差异有统计学意义,加入维拉帕米后,抑制率得到提高,且2-ME和维拉帕米有交互效应。
2.5 形态学观察 见图1。倒置显微镜下可见空白对照组的3种细胞形态完整,呈现长梭形或菱形,生长密集,贴壁良好,相互连接成片,胞质透亮。2-ME作用的细胞相互脱离,易浮起,细胞密度下降;且随着作用时间的延长,细胞间的连接断裂、细胞间隙增大,部分细胞体积缩小,核染色质和胞质浓缩,死细胞增多。加入维拉帕米后,相同2-ME作用浓度下,死细胞增多,总体细胞数量明显减少,剂量依赖性更加明显。
表22 -ME单用及与维拉帕米联合对4T1细胞的抑制率(n=4) %
表32 -ME单用及与维拉帕米联合对SPC-A1细胞的抑制率(n=4) %
表42 -ME单用及与维拉帕米联合对PC-3细胞的抑制率(n=4) %
图12 -ME单用及与维拉帕米联合对4T1、SPC-A1和PC-3细胞形态学的影响(×200)
2.6 2-ME联合维拉帕米对3种细胞的CI 4T1、PC-3和 SPC-A1细胞的 CI分别是0.54、0.77和0.43,均<1,说明有协同作用。
3 讨论
雌激素与乳癌的发生密不可分,身体内雌激素的水平过高会导致乳癌的发生[2]。前列腺的增长和功能的维持依赖于恒定的足够水平的雄激素,在人前列腺基质中存在雌激素受体,通过改变受体表达水平和激活雌激素受体,参与良性前列腺增生及前列腺癌的发生[3]。
2-ME是雌激素的天然代谢产物,在体内细胞中含量量极低。由2-ME对3种肿瘤细胞的IC50可知2-ME对SPC-A1细胞的抑制作用最强,其次是PC3和4T1细胞。分析原因,乳癌和前列腺癌在雌激素的长期刺激下,有可能对和雌激素结构类似的2-ME敏感度下降,疗效降低,导致2-ME对其的抑制作用不如对和雌激素关系欠密切的SPC-A1细胞的强。
有研究[4]表明,癌细胞对某一抗癌药敏感性低或发生耐药性时,其机制大多为抗癌药在细胞内的蓄积浓度下降,维持时间缩短。最近研究[5]认为P-糖蛋白(P-gp)是钙通道的一部分,可被维拉帕米等钙拮抗剂所抑制,减少抗癌药的外流,提高其在细胞内的蓄积浓度,从而增强了药物的抗癌活性。为了证明这一影响因素,作者在2-ME作用于癌细胞的同时加入维拉帕米,考察维拉帕米对2-ME的抗肿瘤增效作用。结果显示加入维拉帕米后2-ME对4T1、SPC-A1和PC-3细胞的IC50均有所下降,协同效应结果也提示维拉帕米可增加2-ME的抗肿瘤效果。
总之,该实验在体外证实钙拮抗剂维拉帕米能增强2-ME对肿瘤细胞的抗癌活性,该结果为2-ME与钙拮抗剂合用治疗癌症的思路提供了一定的实验数据支持。
[1] Agoston GE,Shah JH,Lavallee TM,et al.Synthesis and structure-activity relationships of 16-modified analogs of 2-methoxyestradiol[J].Bioorg Med Chem,2007,15(24): 7524
[2]杨契,韩为东,赵亚力.乳腺癌与雌激素及有关内分泌治疗[J].现代肿瘤医学,2007,15(5):729
[3]Zhou D,Li S,Wang X,et al.Estrogen receptor alpha is essential for the proliferation of prostatic smooth muscle cells stimulated by 17β-estradiol and insulin-like growth factor 1[J].Cell Biochem Funct,2011,29(2):120
[4]Lewinson O,Lee AT,Locher KP,et al.A distinct mechanism for the ABC transporter BtuCD-BtuF revealed by the dynamics of complex formation[J].Nat Struct Mol Biol,2010,17(3):332
[5]Du Y,Shi WW,He YX,et al.Structures of the substratebinding protein provide insights into the multiple compatible solutes binding specificities of Bacillus subtilis ABC transporter OpuC[J].Biocherm J,2011,436(2):283
Growth inhibition effects of 2-methoxyestradiol on 4T1,SPC-A1 and PC-3 cells
WANG Wenjia,ZHANG Zhengquan,JIA Xin,LI Xuebing,ZHANG Zhenzhong School of Pharmaceutical Sciences,Zhengzhou University,Zhengzhou 450001
2-methoxyestradiol;verapamil;synergic index;4T1 cell;SPC-A1 cell;PC-3 cell
Aim:To explore growth inhibition effect of 2-methoxyestradiol(2-ME)on a variety of tumor cells.Methods: The study object was 4T1 cell strain of rat mastocarcinoma,SPC-A1 cell strain of human pulmonary adenocarcinoma and PC-3 cell strain of human prostate cancer.SRB method was adopted to investigate growth inhibition effect of 2-ME on the above tumor cells.In addition,verapamil and synergic index were used to explore the factors influencing 2-ME anti-cancer effect.Results:2-ME had inhibition effects on 4T1,SPC-A1 and PC-3 cells with IC50of 6.11,1.89 and 5.12 μmol/L,respectively.After verapamil was adopted,the inhibitory rate was significantly higher than that of the single-drug group(P<0.01),and IC50dropped to 2.01,0.57 and 2.77 μmol/L,respectively,with the synergic index distributed within 0.77~0.43.Conclusion:2-ME has inhibition effects on the three kinds of tumor cells,and verapamil has obvious synergistic effect on 2-ME.
R979.1
10.3969/j.issn.1671-6825.2012.06.017
(2012-03-11收稿 责任编辑赵秋民)