钙通道阻滞剂对原代培养醛固酮产生腺瘤细胞类固醇激素谱的影响

高寅洁，禹松林，尹逸丛，崔云英，张玉石，邱 玲，童安莉*

(中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院 1.内分泌科 国家卫生健康委员会内分泌重点实验室；2.检验科 疑难重症及罕见病国家重点实验室；3.泌尿外科，北京 100730)

醛固酮产生腺瘤(aldosterone producing adenoma，APA)是原发性醛固酮增多症(primary aldoster-onism，PA)的第二大病因，主要是由于KCNJ5、ATP2B3、ATP1A1和CACNA1D等体细胞基因突变所致。以上突变均会导致细胞膜电位变化，使细胞去极化，激活细胞内钙信号，从而促进醛固酮分泌。由于钙通道激活是APA中醛固酮合成分泌增多的主要机制，因此用钙通道阻滞剂(calcium channel blocker，CCB)能够阻断APA的醛固酮分泌。既往研究已证实CCB能减少人肾上腺皮质腺癌细胞系NCI-H295R以及原代培养APA细胞的醛固酮分泌[1-2]，但其对于除醛固酮外其他类固醇激素的作用尚无文献证实。

近几年，液相色谱-串联质谱(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)被认为是检测类固醇激素谱的金标准[3]。本研究旨在以原代培养细胞为模型，借助LC-MS/MS方法，探究L型CCB药物维拉帕米(verapamil)处理前后，原代APA细胞的多种类固醇激素水平的差异。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 对象：取材来自于北京协和医院2021年3月手术的伴有低钾血症的APA患者的肿瘤组织。APA诊断标准参考国际内分泌学会临床实践指南[4]。本研究经北京协和医院伦理委员会批准(批准号: JS-1595和JS-1596)，所有对象及其监护人均签署了知情同意书。

1.1.2 药物/试剂：Ⅰ型胶原酶(Gibco公司)；DMEM/F12培养基(Hyclone公司)；标准级胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；青链霉素(×100)、1×PBS和红细胞裂解液(北京索莱宝科技有限公司)；维拉帕米(verapamil)(MedChemExpress公司)；组织DNA提取试剂盒(Omega公司)；2×GoldStar Best MasterMix(康为世纪生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 资料的收集：收集患者基本情况、平均诊断年龄、高血压病程及最高收缩压/舒张压、低血钾病程及最低血钾、肿瘤位置、肿瘤最大直径和实验室检查结果[术前立位醛固酮、血管紧张素Ⅱ及肾素活性(renin activity，PRA)，血总皮质醇、促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropic hormone,ACTH)及24 h尿游离皮质醇(24h-UFC)]等。

1.2.2 肿瘤组织KCNJ5热点突变检测：提取患者组织DNA进行PCR扩增及Sanger测序，用以检测两种常见的KCNJ5基因突变G151R及L168R。扩增及测序引物如下：上游引物F：5′-CGCTTCAAC TTGCTCGTCTT-3′，下游引物R：5′-ATGAACTCCCCC TCTTTGGT-3′。扩增产物送北京诺赛基因组研究中心测序，结果比对NCBI网站KCNJ5序列(参考碱基序列NM_000890.5，参考蛋白序列NP_000881.3)。

1.2.3 原代培养人APA细胞的方法[5]参考已发表文献。

1.2.4 CCB维拉帕米处理原代培养人APA细胞：原代培养细胞于6孔板培养2～4 d，实验组加入终浓度为10 μmol/L和50 μmol/L的维拉帕米。药物处理48 h，收取培养液，于-20 ℃保存，用于LC-MS/MS检测类固醇激素谱。

1.2.5 LC-MS/MS检测细胞培养液类固醇激素谱：LC-MS/MS检测方法参考已发表文献[6]。检测类固醇包括孕烯醇酮(pregnenolone)、孕酮(progesterone)、11-脱氧皮质酮(11-deoxycorticosterone)、皮质酮(corticosterone)、醛固酮(aldosterone)、17-羟-孕烯醇酮(17-OH-pregnenolone)、17α-羟-孕酮(17a-hydroxyprogesterone)、11-脱氧皮质醇(11-deoxycortisol)、皮质醇(cortisol)、21-脱氧皮质醇(21-deoxycortisol)、可的松(cortisone)、脱氢表雄酮(dehydroepipiandrosterone,DHEA)、雄烯二酮(androstenedione)、睾酮(testosterone)、双氢睾酮(dihydrotestosterone,DHT)、硫酸脱氢表雄酮(dehydroepipiandrosterone sulfate,DHEA-S)、18-氧-皮质醇(18-oxocortisol,18-OXOF)、雌酮(estrone,E1)、雌二醇(estradiol,E2)、雌三醇(estriol,E3)、18-羟-皮质醇(18-hydroxycortisol,18-OHF)、11β-羟-睾酮(11 beta-hydroxytestosterone,11β-OHT)和11-酮-睾酮(11-ketotestoster-one,11-KT)。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 基本情况

6例APA患者手术切除组织被成功培养，患者的基本临床资料见表1。6例患者均接受了肾上腺肿瘤切除术，术后病理提示为肾上腺皮质腺瘤。术后6个月随访患者高血压均一定程度缓解，血钾均恢复至正常水平。

表1 原代培养人APA细胞取材患者的临床资料

2.2 KCNJ5突变检出情况

6例患者组织提取DNA并进行KCNJ5热点突变位置测序，5例患者携带KCNJ5热点突变p.G151R，其中2例检出突变c.451G>C, p.G151R，3例检出突变c.451G>A, p.G151R(图1)。

A.position indicated by the arrow is c.451G>C; B.position indicated by the arrow is c.451G>A

2.3 LC-MS/MS检测类固醇激素谱

维拉帕米 50 μmol/L组醛固酮水平低于维拉帕米 10 μmol/L组低于对照组(P<0.01)。6例原代培养APA细胞维拉帕米 10 μmol/L组和维拉帕米 50 μmol/L组与对照组相比，平均醛固酮下降百分数分别为48.2%和82.0%。

维拉帕米 10 μmol/L组的11-脱氧皮质酮、孕烯醇酮和孕酮水平显著低于对照组(P<0.05)。维拉帕米 50 μmol/L组和维拉帕米10 μmol/L组的18-氧-皮质醇和18-羟-皮质醇水平均低于对照组(P<0.05)。

除了盐皮质激素外，各组间糖皮质激素包括皮质醇和可的松的水平也存在统计学差异，维拉帕米 50 μmol/L组和维拉帕米10 μmol/L组的皮质醇水平均低于对照组(P<0.05)；维拉帕米 10 μmol/L组的可的松和17α-羟-孕酮水平显著低于对照组(P<0.05)。

性激素方面，维拉帕米 50 μmol/L组硫酸脱氢表雄酮水平低于维拉帕米 10 μmol/L组低于对照组(P<0.05)；维拉帕米 50 μmol/L组和维拉帕米10 μmol/L组的11-羟-睾酮水平均低于对照组(P<0.05)。各组间其余类固醇激素水平差异无统计学意义(表2)。

表2 LC-MS/MS检测各组细胞培养液类固醇激素水平的差异

3 讨论

既往研究表明，L型CCB维拉帕米可以浓度依赖方式减少血管紧张素Ⅱ诱导或KCNJ5突变型细胞的醛固酮合成，以及醛固酮合成酶CYP11B2 mRNA和蛋白的表达[7]。本课题组曾成功培养1例KCNJ5突变的患者增生的肾上腺组织，结果显示维拉帕米 10 μmol/L处理可显著抑制醛固酮的合成[8]。本研究以6例APA体外原代培养细胞进行研究，发现维拉帕米药物处理对醛固酮分泌的抑制作用明确，未来是否可以用于APA的辅助治疗有待进一步体内研究证实。

本研究发现CCB药物除了能够减少醛固酮的分泌外，对于原代培养的APA细胞的其他多种类固醇激素均有显著的抑制作用。这与既往研究结果一致，由于KCNJ5突变APA存在肾上腺球状带和束状带混合表型，肾上腺束状带细胞在CYP11B2的作用下将11-脱氧皮质醇代谢为18-氧-皮质醇和18-羟-皮质醇[9]。然而，经较高浓度维拉帕米处理后部分类固醇激素出现“反跳”，如孕烯醇酮、孕酮、11-脱氧皮质酮和11-酮-睾酮等在维拉帕米10 μmol/L浓度下可被抑制，但在维拉帕米50 μmol/L浓度下分泌增加而高于其他两组。研究表明，维拉帕米除了能够抑制钙通道，同样也能够抑制MDR1/P-glycoprotein蛋白(ABCB1编码)，而该蛋白的异常表达会干扰人类固醇激素分泌和清除过程中的平衡[10]。既往文献也指出ABCB1的多态位点能够影响皮质醇和醛固酮的分泌水平[11]以及肾素-血管紧张素系统的活性[12]。因此，猜测这种“反跳”现象的出现可能与维拉帕米的多靶点有关。

此外，本研究发现原代培养APA细胞存在网状带激素的分泌，如雄烯二酮、睾酮、硫酸脱氢表雄酮、11-羟-睾酮和11-酮-睾酮等。且CCB药物对原代培养的APA细胞的硫酸脱氢表雄酮和11-羟-睾酮同样也有明显的抑制作用。CCB药物抑制APA细胞肾上腺来源的性激素分泌的原因尚不清楚，未来仍需要进一步研究。

综上，CCB药物除了能够抑制原代培养APA 细胞的醛固酮分泌外，对其他多种类固醇激素，如醛固酮前体物质11-脱氧皮质酮、皮质醇以及代谢产物18-氧-皮质醇和18-羟-皮质醇均有显著的抑制作用。APA患者的类固醇激素谱特征及CCB药物在辅助治疗中的作用有待体内研究证实。