LNCaP冻融抗原致敏的树突状细胞诱导的CTL对LNCaP细胞的杀伤作用*

单 磊，郝建伟，王向阳

河南省人民医院泌尿外科郑州 450003

#通讯作者，男，1974年7月生，博士，主治医师，研究方向:泌尿系肿瘤，E-mail:exwhao@126.com

LNCaP冻融抗原致敏的树突状细胞诱导的CTL对LNCaP细胞的杀伤作用*

单 磊，郝建伟#，王向阳

河南省人民医院泌尿外科郑州 450003

#通讯作者，男，1974年7月生，博士，主治医师，研究方向:泌尿系肿瘤，E-mail:exwhao@126.com

树突状细胞;前列腺癌;免疫治疗

目的:研究负载LNCaP冻融抗原的树突状细胞(DC)诱导的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对前列腺癌LNCaP细胞的杀伤效应。方法:采用反复冻融法获得LNCaP细胞抗原，联合应用rhIL-4、rhGM-CSF和TNF-α体外诱导人外周血单个核细胞为成熟DC，并用LNCaP细胞冻融抗原致敏，用该致敏DC体外诱导CTL，观察CTL对LNCaP细胞的特异性杀伤作用，并采用ELISA法检测致敏DC IL-12 p70的分泌量。以未致敏DC为对照。结果:冻融抗原致敏DC诱导的CTL对LNCaP细胞具较高杀伤率，该作用强于未致敏DC，且当效靶比为20∶1时效用最显著(F组别=68.314，F效靶比=7.251，F交互=56.233，P＜0.05);与未致敏DC相比，致敏DC IL-12 p70分泌量显著增加(t=4.020，P=0.002)。结论:LNCaP冻融抗原致敏DC激活的CTL在体外具有更强的杀伤LNCaP细胞的作用。

前列腺癌是男性泌尿生殖系最常见的恶性肿瘤之一［1］，目前对晚期前列腺癌仍没有有效的治疗方法，但免疫治疗已逐渐受到人们的重视。树突状细胞(dendritic cell，DC)是功能最强的专职抗原呈递细胞。在体外制备负载肿瘤抗原的特异性DC肿瘤疫苗，再注射回体内，激发机体产生主动性抗肿瘤免疫反应，是具有良好前景的肿瘤生物治疗方案。作者用外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)诱导DC并负载LNCaP冻融抗原，用其刺激淋巴细胞，获得特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes，CTL)，观察该效应细胞对前列腺癌LNCaP细胞活性的影响，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 人外周血标本取自该院健康志愿者，年龄20～35岁，均在献血后2 h内进行PBMC的分离。人前列腺癌细胞株LNCaP为该科室保存。胎牛血清及RPMI 1640培养液均为美国Gibco公司产品。Ficoll分离液购自上海试剂二厂。rhIL-4、rh-GM-CSF及rhTNF-α购自Peprotech EC公司。MTT试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司。ELISA试剂盒为美国R＆D公司产品。Bradford蛋白浓度测定试剂盒为TPI公司产品。

1.2 LNCaP细胞冻融抗原的制备 常规培养并收集对数生长期LNCaP细胞，用PBS调整密度为2× 106mL－1，于－80℃放置20 min，迅速于37℃放置10 min，反复冻融3次。经微孔滤膜过滤后即得可溶性LNCaP冻融抗原，按Bradford蛋白浓度测定试剂盒说明书所示方法测量、计算抗原的蛋白浓度，－20℃ 保存备用。

1.3 DC和T淋巴细胞的制备 取肝素抗凝的HLA-A2阳性健康志愿者外周血 50 mL，Ficoll-Hypaque密度梯度分离，制成PBMC悬液。调整细胞密度为2×106mL－1，在37℃、体积分数5%CO2条件下培养2 h。收集上清液，加入IL-2(200 kU/ L)，37℃、体积分数5%CO2条件下培养3 d收集、纯化T淋巴细胞。取贴壁细胞，加入50 μg/L rhIL-4、100 μg/L rhGM-CSF和体积分数10%胎牛血清，隔日更换培养基并加入细胞因子，第5日起加入100 μg/L TNF-α，第9天收获细胞进行DC形态学鉴定、细胞毒性实验。

1.4 LNCaP冻融抗原对DC的致敏 收集上述DC，以1×106mL－1接种于6孔板中，以DC与抗原(以冻融前肿瘤细胞的量计)的比例1∶3加入LNCaP冻融抗原，于37℃、体积分数5%CO2条件下过夜培养。

1.5 致敏DC诱导的CTL对LNCaP细胞的杀伤效应 收集致敏DC，与培养3 d的T细胞按50∶1的比例混合后于37℃、体积分数5%CO2培养24 h，所获细胞即为CTL。分别以CTL、未负载冻融抗原的DC诱导的T细胞和IL-2诱导的T细胞为效应细胞，以LNCaP细胞为靶细胞，按效靶比20∶1、10∶1和1∶1共培养12 h，然后采用MTT法检测细胞活性，酶标检测仪检测波长570 nm处的吸光度(A)值，按公式计算细胞杀伤率:杀伤率=(靶细胞A值－效应细胞A值)/靶细胞A值×100%。

1.6 DC的IL-12 p70分泌量的测定 分别收集致敏DC和未致敏DC，每组细胞设3个复孔。培养9 d后收集上清液100 μL，进行IL-12 p70检测，按IL-12 p70 ELISA检测试剂盒使用说明进行操作。

1.7 统计学处理 采用SPSS 11.5进行数据分析，采用析因设计的方差分析评估致敏DC诱导的CTL对LNCaP细胞的杀伤率，应用成组设计t检验比较致敏和未致敏DC IL-12 p70分泌量的差异，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 DC的形态学观察 PBMC悬液培养3 h后收获黏附细胞，加入细胞因子培养3 d后可见贴壁细胞有明显的集落形成，同时悬浮细胞增多，体积增大，细胞形态不规则;随着培养时间的延长，悬浮细胞逐渐增多，体积增大更明显，细胞具有不规则细胞核并且胞膜可见毛刺状或根须状突起;第9天时，细胞体积进一步增大，毛刺状突起增多，并且细胞多数呈集束样悬浮或散在生长，呈多边形，具有典型的分叶型细胞核和长的突起(图1)。

图1 成熟DC的表现(电子显微镜，×3 360)

2.2 致敏DC诱导的CTL对LNCaP细胞的杀伤效应 LNCaP冻融抗原致敏DC诱导的CTL对LNCaP细胞具有较高的特异性杀伤效应，不同效靶比时的杀伤率见表1，可以看出，当效靶比为20∶1时CTL对肿瘤细胞的杀伤效应最为明显。2.3 DC的IL-12 p70分泌量 致敏DC的IL-12 p70分泌量为(85.5±6.4)ng/L，未致敏DC分泌量为(63.4±5.5)ng/L，2者比较，差异有统计学意义(t=4.020，P=0.002)。

表1 DC诱导的CTL对LNCaP细胞的杀伤率(n=3)

3 讨论

DC能显著刺激初始型T细胞增殖，在机体抗肿瘤的作用中起关键的始动作用［2］。非成熟的DC捕获抗原后分化为成熟DC，并将抗原肽递呈给T淋巴细胞，诱导产生CTL，促进CTL分泌细胞因子(如IL-12、IFN-γ)，产生Th1型免疫应答，发挥抗肿瘤作用［3］。在荷瘤患者体内存在抗原呈递细胞数量不足和功能低下，以及肿瘤相关抗原性弱或具有抗原调变现象，这两个重要原因均可导致机体无法识别和递呈肿瘤抗原，不能激发有效的CTL抗肿瘤免疫反应，使肿瘤细胞逃避机体的免疫监视，导致肿瘤的形成和发展［4］。研究［5］表明，前列腺癌细胞可抑制DC的产生和成熟，并且前列腺癌组织中DC凋亡增加，致使DC减少。目前，体外培养、诱导DC的技术已基本成熟，但因前列腺癌特异性抗原较少，而由少部分已知的前列腺癌抗原制成的肿瘤疫苗产生的抗肿瘤效果仍不理想［6］。因此，负载瘤细胞全部抗原信息的疫苗成为研究热点。

该实验中，作者采用冻融的LNCaP细胞裂解物致敏DC，该方法无需分离鉴定肿瘤的特异性抗原，由DC完成对瘤细胞全部抗原的识别、摄取、加工及递呈，并且可能激发多个肿瘤相关抗原的T细胞免疫反应，不仅简便易行，还可增强抗肿瘤作用。细胞毒性实验结果显示，由LNCaP冻融抗原致敏DC诱导的CTL比未致敏DC诱导的T淋巴细胞能更明显地杀伤LNCaP细胞，一方面间接说明前列腺癌LNCaP细胞冻融抗原能促进DC的成熟，另一方面也证实负载冻融抗原DC激活的CTL在体外能有效杀伤LNCaP细胞。

IL-12可由B细胞、肥大细胞、中性粒细胞产生，但主要来源于DC的分泌。IL-12 p70可作为DC功能成熟的指标，其具有增强DC呈递抗原、活化T淋巴细胞产生抗原特异性免疫应答的能力［7］。该实验结果显示，负载肿瘤抗原DC的IL-12 p70分泌量明显高于未负载抗原DC，说明LNCaP冻融抗原可以作为刺激信号上调DC分泌IL-12 p70的水平，促进DC的功能成熟。

综上所述，负载前列腺癌细胞冻融抗原的DC具有很强的抗原递呈作用，这种DC瘤苗可有效诱导特异性CTL，产生高效抗肿瘤效应，这为DC瘤苗用于治疗前列腺癌及预防前列腺癌术后转移和复发提供了理论依据。

［1］Jemal A，Siegel R，Ward E，et al.Cancer statistics，2009［J］.CA Cancer J Clin，2009，59(4):225

［2］Turtle CJ，Hart DN.Dendritic cells in tumor immunology and immunotherapy［J］.Curr Drug Targets，2004，5(1):17

［3］Jalili A.Dendritic cells and their role in cancer immunotherapy［J］.Iran J Immunol，2007，4(3):127

［4］叶枫，陈怀增，谢幸，等.卵巢癌细胞株冻融抗原负载的树突状细胞诱导CTL抗卵巢癌免疫应答的体外研究［J］.中华微生物学和免疫学杂志，2004，24(12):964

［5］ Aalamian M，Pirtskhalaishvili G，Nunez A，et al.Human prostate cancer regulates generation and maturation of monocyte-derived dendritic cells［J］.Prostate，2001，46(1):68

［6］Waeckerle-Men Y，Uetz-von Allmen E，Fopp M，et al.Dendritic cell-based multi-epitope immunotherapy of hormonerefractory prostate carcinoma［J］.Cancer Immunol Immunother，2006，55(12):1524

［7］李东印，闵军，褚忠华，等.抗原负载的树突状细胞体外诱导抗肿瘤免疫的研究［J］.中华实验外科杂志，2008，25(9):1146

Effects of cytotoxicity T lymphocyte activated by dendritic cell loaded with LNCaP cell line frozen-thawing antigen on LNCaP cell

SHAN Lei，HAO Jianwei，WANG XiangyangDepartment of Urology，Henan Provincial People’s Hospital，Zhengzhou 450003

dendritic cell;prostate cancer;immunotherapy

Aim:To investigate the immune responses of cytotoxic T lymphocytes(CTL)against prostate cancer cell LNCaP after activated by dendritic cell(DC)loaded with LNCaP frozen-thawing antigen in vitro.Methods:LNCaP cells were frozen and melt repeatedly 3 times，then tumor lysate was obtained.After separated from heparinized venous blood of healthy donors by Ficoll-Hypaque density-gradient centrifugation，peripheral blood mononuclear cells(PBMCs)were cultured and induced by rhIL-4 and rhGM-CSF and TNF-α to differentiate into DC.The cytotoxicity of CTL activated by DCs loaded with frozen-thawing antigen and cytokine release were measured by MTT assay and ELISA.Results:DCs could be harvested through healthy donors’PBMCs cultured in vitro.CTL activated by lysate-loaded DCs had more evident cytotoxicity against LNCaP cells in vitro(Fgroup=68.314，Fratio=7.251，Finteraction=56.233，P＜0.05).The level of DCs excreting IL-12，which sensitized by LNCaP lysate，was higher than that of unsensitized DCs(t=4.020，P=0.002).Conclusion: CTL activated by DCs loaded with LNCaP frozen-thawing antigen exerts a remarkable killing activity on LNCaP cell in vitro.

R737.25

10.3969/j.issn.1671-6825.2012.06.023

*河南省卫生厅科技攻关基金资助项目 200903134

(2012-12-05收稿 责任编辑王 曼)