糙皮侧耳碱提水溶性多糖对肿瘤的抑制作用及其机制

2012-12-06孔繁利佟海滨李玉林

吉林大学学报（医学版） 2012年6期

孔繁利，孙新，佟海滨，林琪，刘妍，李玉林

（1.吉林大学白求恩医学院病理生物学教育部重点实验室，吉林长春130021；2.北华大学基础医学院病理生理学教研室，吉林吉林132013；3.北华大学生命科学研究中心，吉林吉林132013）

孔繁利1，2，孙新3，佟海滨3，林琪3，刘妍3，李玉林1

目的：研究糙皮侧耳（Pleurotus ostreatus）碱提水溶性多糖对肿瘤的抑制作用，并探讨其作用机制。方法：通过碱液提取、乙醇沉淀、联合脱蛋白和柱层析方法，分离得到粗皮侧耳碱提水溶性多糖WPOP－N1；BalB／C小鼠前肢腋皮下注射S－180肉瘤细胞建立肿瘤小鼠模型，将60只雌性小鼠随机分为正常对照组、模型对照组、环磷酰胺阳性对照组（30 mg·kg－1）、WPOP－N1低、中和高剂量组（100、200和400 mg·kg－1），每组10只。除正常对照组外，在每只小鼠的前肢腋皮下注射S－180肉瘤细胞悬液，对照组小鼠给予生理盐水，模型对照组小鼠给予脂多糖10 mg·L－1。采用ELISA法检测各组小鼠血清TNF－α水平，评价WPOP－N1对巨噬细胞吞噬作用，NO和TNF－α水平的影响。结果：WPOP－N1低、中和高剂量组小鼠瘤质量分别为（2.38±0.55）、（1.79±0.64）和（1.37±0.51）g，均低于正常对照组［（3.71±0.81）g］（P＜0.05）；WPOP－N1低、中和高剂量组抑瘤率分别为35.8%、51.8%和63.1%；WPOP－N1中、高剂量组荷瘤小鼠血清TNF－α水平高于正常对照组（P＜0.05或P＜0.01）；腹腔巨噬细胞的吞噬能力高于正常对照组（P＜0.05或P＜0.01）；WPOP－N1低、中和高剂量组小鼠腹腔巨噬细胞分泌NO和TNF－α水平升高（P＜0.05），并具有剂量效应。结论：WPOP－N1具有显著的体内肿瘤抑制作用，其作用机制可能是活化巨噬细胞分泌NO和TNF－α，并增强巨噬细胞的吞噬能力。

糙皮侧耳；多糖；免疫调节；巨噬细胞

侧耳属（Pleurotus）为真菌中最高级的担子菌纲，广泛分布于全球各地。目前，全世界已发现的侧耳属约有50多种，我国的侧耳资源较为丰富，已知的种类约达36种。在众多侧耳属成员当中，糙皮侧耳（P.ostreatus）因其易于栽培、产量大，成为全世界最重要的人工培育食用真菌之一［1］。糙皮侧耳不仅味道鲜美，而且营养丰富，除含有蛋白质、必需氨基酸、脂肪和多种微量元素外，还富含约60%的多糖成分。近年来研究［2－3］表明：真菌多糖是一类重要的生物活性物质，在国际上被称为生物响应调节因子（biological response modifiers，BRMs）或免疫增强剂。多种真菌多糖可通过刺激免疫系统，调节人体的免疫机能，达到治疗多种疾病的目的，具有潜在的临床应用价值与开发前景［4－5］。有文献报道：热水提取得到的糙皮侧耳糖复合物具有体内抗Sarcoma－180（S－180）肉瘤细胞的活性，而关于碱提糙皮侧耳多糖的研究未见报道。本研究通过系统分级纯化，得到糙皮侧耳碱提水溶性多糖级份WPOP－N1，通过体内外模型对其免疫调节和抗肿瘤方面的作用进行初步探讨，为糙皮侧耳的深入研究和开发利用提供基础。

1 材料与方法

1.1 动物、细胞株和主要试剂及仪器雌性BalB／C小鼠60只，体质量18～22 g，由吉林大学实验动物中心提供（合格证号：SCXK－吉－2010－0002），饲养温度为（25±2）℃，光照时间为明暗各12 h，饲养于相对湿度为60% 的饲养室中，自由饮水和取食。S－180小鼠肉瘤细胞购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。RPMI 1640培养液（Gibco公司），胎牛血清（Hyclone公司），96孔细胞培养板（Nunc），环磷酰胺（江苏恒瑞制药公司），二甲基亚砜（北京鼎国生物技术有限公司），鼠 TNF－alpha ELISA 试剂盒（Pepro Tech 公司），Sepharose CL－6B 凝胶（Pharmcia公司），DEAE－纤维素、蓝色葡聚糖（Blue dextran 2000）和标准相对分子质量葡聚糖（Dextran，Sigma 公司）；酶标仪（BIO－RAD 680），分析天平（Sartorius公司），CO2培养箱（Thermo Scientific公司），高速冷冻离心机（Beckman公司），倒置显微镜（Olympus公司）。

1.2 糙皮侧耳多糖碱提及纯化将乙醇脱脂处理后的糙皮侧耳残渣烘干，加10倍体积蒸馏水于80℃反复提3次。过滤后将残渣烘干，向残渣中加入5倍体积的0.5 mol·L－1NaOH溶液，50℃反复浸提3次。合并提取液后，以冰醋酸进行中和，并减压浓缩至原体积的1／10，离心去除不溶物，透析过夜。向透析后的提取液中加入4倍体积的95%乙醇，4℃下静置醇析过夜。经离心后，分别利用乙醇、乙醚对沉淀进行脱脂、脱水漂洗。蒸馏水溶解干燥的沉淀后，利用反复冻融、酶法以及Sevag法联合除蛋白［6］。除去蛋白后的粗多糖溶液用蒸馏水透析过夜后，冷冻干燥得到糙皮侧耳碱提水溶性总多糖WPOP。经蒸馏水溶解和过滤后，进一步利用DEAE－纤维素离子交换和Sepharose CL－6B凝胶过滤柱层析对 WPOP进行分级纯化，得到碱提水溶性糙皮侧耳多糖主要组分WPOP－N1。

1.3 WPOP－N1基本理化性质分析利用苯酚硫酸法、Bradford 法和间羟联苯法［7－8］分别检测WPOP－N1中总糖水平、蛋白水平和糖醛酸水平。采用高效液相色谱法（HPLC）测定 WPOP－N1均一度和平均相对分子质量。通过乙酰化衍生后，采用气相色谱法（GC）检测WPOP－N1中的单体组成。

1.4 小鼠体内抗肿瘤实验将60只雌性小鼠随机分为6组，每组10只，分别为正常对照组、模型对照组、环磷酰胺阳性对照组（30 mg·kg－1）、WPOP－N1 低、中、高剂量组（100、200 和400 mg·kg－1）。除正常对照组小鼠外，其他各组小鼠的前肢腋皮下注射S－180肉瘤细胞悬液（1×107·m L－1）0.2 m L，注射24 h后，每天灌胃给药1次，药物以生理盐水作为溶剂，连续给药21 d，对照组小鼠给予生理盐水，模型对照组小鼠给予脂多糖10 mg·L－1。各组小鼠末次给药后24 h，眼球取血，制备血清，－20℃保存，用于TNF－α水平的检测。颈椎脱臼处死小鼠，剥离肿瘤并称质量，按下式计算抑瘤率：抑瘤率（%）＝（模型对照组平均瘤质量－实验组平均瘤质量）／模型对照组平均瘤质量×100%。

1.5 小鼠腹腔巨噬细胞培养及其吞噬作用检测腹腔巨噬细胞的培养［9］：酒精消毒腹膜壁后，向小鼠腹腔注入6%无菌淀粉肉汤溶液（3 m L）。3 d后处死小鼠，用3 m L PBS冲洗腹腔，收集腹腔液，4℃、1500 r·min－1离心10 min，用RPMI 1640完全培养基重悬细胞。调整细胞浓度为1×106m L－1，置于6孔培养板中，37℃培养3 h后，弃去未贴壁细胞，贴壁细胞即为腹腔巨噬细胞。台盼兰染色法进行镜下细胞计数，细胞存活率在95%以上为可用。中性红法检测巨噬细胞吞噬作用［10］：向纯化后的腹腔巨噬细胞中加入不同浓度WPOP－N1（每孔200μL），继续培养24 h，吸去上清，每孔加入100μL中性红溶液（0.075%PBS），继续培养1 h，用PBS（p H＝7.4）洗去剩余的中性红后，加入100μL的细胞裂解液（乙醇∶乙酸＝1∶1，V／V）完全裂解细胞后，利用酶标仪检测波长550 nm处的吸收值，吸光值的大小用于反映巨噬细胞的吞噬能力强弱。

1.6 NO生成量的检测采用Griess试剂法测定培养上清亚硝酸盐的含量，间接反映NO的生成量［11］。腹腔巨噬细胞与不同浓度的 WPOP－N1共培养（如1.5方法所述），取上清液与同体积Griess reagent（1%氨基苯磺酰胺，0.1%N－萘基乙二胺，2.5%磷酸）混合，室温孵育10 min，利用酶标仪在波长570 nm处测量吸光值。以NaNO2作为标准品绘制标准曲线，计算各组小鼠巨噬细胞释放NO的生成量。

1.7 肿瘤坏死因子TNF－α水平的检测取荷瘤小鼠血清和腹腔巨噬细胞与 WPOP－N1共培养（如1.5方法所述）的培养基上清液，利用ELISA试剂盒检测TNF－α水平。

1.8 统计学分析采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析。小鼠瘤质量、血清TNF－α水平、巨噬细胞吞噬能力、NO和TNF－α分泌量均以±s表示，组间比较采用t检验。

2 结果

2.1 WPOP－N1的基本理化性质分析 WPOP－N1为灰白色粉末，不溶于乙醇、丙酮等有机溶剂。经苯酚硫酸法测定其总糖含量为97.6%，Bradford法和间羟联苯法测定结果呈阴性反应，说明WPOP－N1中不含蛋白和糖醛酸。HPLC测定WPOP－N1的平均相对分子质量为48200。WPOP－N1经乙酰化修饰后，利用GC分析其单体组成，WPOP－N1主要由甘露糖和葡萄糖构成。

2.2 各组荷瘤小鼠的抑瘤率和血清TNF－α水平WPOP－N1灌胃连续给药21 d后，WPOP－N1低、中和高剂量组荷瘤小鼠的肿瘤质量显著减小，环磷酰胺阳性对照组和WPOP－N1低、中、高剂量组抑瘤率分别为71.7%、35.8%、51.8%和63.1%。ELISA试剂盒检测，WPOP－N1低、中和高剂量组荷瘤小鼠血清TNF－α的浓度升高，并呈现剂量依赖效应，中、高剂量组与正常对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。见表1。

表1 WPOP－N1的体内抗肿瘤活性及血清TNF－α表达水平Tab.1 The anti－tumor activities of WPOP－N1 in vivo and the expression level of serum TNF－α

2.3 各组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬活性与正常对照组（平均吸光值为0.31）比较，模型对照组、WPOP－N1低、中和高剂量组平均吸光值分别为0.65、0.38、0.47和0.62。随着 WPOP－N1剂量的增加，巨噬细胞的吞噬能力逐渐增强，中、高剂量组与正常对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。WPOP－N1高剂量组作用效果接近模型对照组，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.4 各组小鼠腹腔巨噬细胞分泌NO和TNF－α水平

WPOP－N1各剂量组小鼠腹腔巨噬细胞NO和TNF－α水平升高，具有剂量效应，WPOP－N1高剂量组NO和TNF－α水平基本接近模型对照组（P＞0.05）。

表2 各组小鼠腹腔巨噬细胞分泌NO和TNF－α水平Tab.2 Levels of NO and TNF－αsecreted by peritoneal macrophages of mice in various groups

3 讨论

自然界中现存的真菌有20～25万种，中国已报道的食用真菌将近1000种，其中具有传统药用价值的达300多种，是有待开发的重要药用资源宝库。研究［12］表明：多种食用真菌多糖均具有免疫调节和抗肿瘤作用，其最大的优点是毒副作用少、细胞毒性小，而且药物质量通过化学手段容易控制。

真菌多糖的提取主要以水提法居多，碱提多糖的构象分析和活性报道较少。为了充分发掘糙皮侧耳的药用价值和糙皮侧耳中筛选新型抗癌药物的先导化合物，本研究利用碱提法分离纯化糙皮侧耳多糖，并鉴定其生物活性。20世纪90年代，国外学者对糙皮侧耳水溶性多糖研究［13］发现：水提糙皮侧耳多糖为葡聚糖，并含有少量的甘露糖残基。本研究采用碱提法获得的多糖组分WPOP－N1以甘露糖为主，甘露糖与葡萄糖的摩尔比为5.6∶3.3，可能的原因是水提法无法充分细胞壁中的多糖成分，而碱性溶液能够破坏细胞壁，从而得到水提法无法获得的多糖组分。李华等［5］利用水提法得到的糙皮侧耳糖肽（POGP），S－180荷瘤小鼠口服给药后，POGP显示了极强的抑瘤活性。姜自彬等［14］对POGP的理化性质进行深入研究发现：POGP在体外对S－180小鼠肉瘤细胞也具有极强的抑制作用，而对小鼠正常细胞无细胞毒作用。本研究结果表明：WPOP－N1具有很强的体内抗肿瘤效果，但POGP具有选择性的细胞毒性，可以直接在体外抑制S－180细胞增殖。MTT实验发现：WPOP－N1没有细胞毒性，不能在体外直接杀伤肿瘤细胞。上述结果提示：碱提法得到的WPOP－N1与水提法制备的POGP可能拥有不同的抗肿瘤作用机制。

基于以往对多糖免疫调节活性的报道，本课题组进一步研究WPOP－N1对小鼠体液免疫与细胞免疫的影响。本研究检测荷瘤小鼠血清中TNF－α水平结果显示：WPOP－N1可以显著提高荷瘤小鼠血清中TNF－α水平，提示 WPOP－N1的抗肿瘤作用可能在于其免疫调节功能。本研究分离并体外培养小鼠腹腔巨噬细胞结果显示：WPOP－N1对小鼠巨噬细胞的吞噬能力有明显的促进作用。此外，NO与TNF－α是巨噬细胞释放的作为杀伤肿瘤细胞的重要化学介质，本研究采用WPOP－N1刺激后的巨噬细胞培养基上清进行检测发现：NO与TNF－α的水平均显著上升，上述结果均说明WPOP－N1能增强小鼠免疫功能。

综上所述，本研究利用碱提法从糙皮侧耳中提取得到新的多糖组分WPOP－N1，后者与水提法得到的POGP具有不同的抗癌作用机制。WPOP－N1对肿瘤的抑制作用主要通过活化免疫功能所介导，WPOP－N1可以明显改善荷瘤小鼠的免疫功能，并能有效刺激小鼠巨噬细胞的活化状态。

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Inhibitory effect of water－soluble polysaccharide alkali－extracted from Pleurotus ostreatus and its mechanism

KONG Fan－li1，2，SUN Xin3，TONG Hai－bin3，LIN Qi3，LIU Yan3，LI Yu－lin1
（1.Key Laboratory of Pathobiology，Ministry of Education，Norman Bethune College of Medicine，Jilin University，Changchun 130021，China；2.Department of Pathophysiology，School of Basic Medical Sciences，Beihua University，Jilin 132013，China；3.Research Center of Life Sciences，Beihua University，Jilin 132013，China）

Objective To study the inhibitory effect of water－soluble polysaccharide alkali－extracted from Pleurotus ostreatus and to clarify its mechanism.Methods The water－soluble polysaccharide WPOP－N1 from Pleurotus ostreatus were obtained by alkaline extraction，ethanol precipitation，and joint deproteinized and column chromatography methods.Forelimbs of BalB／C mice were subcutaneously injected with S－180 sarcoma cells to establish mouse tumor models.60 BalB／C mice were randomly divided into normal control group，model control group，cyclophosphamide（positive control）group，WPOP－N1 low，medium，high doses groups（100，200 and 400 mg·kg－1），and there were 10 mice in each group.Besides normal control group，the mice in the other groups were subcutaneously injected with S－180 sarcoma cells suspensions，and the mice in normal control group were given saline and the mice in model control group were given lipopolysaccharide.The levels of serum TNF－αsecreted were detected by ELISA method.The effects of WPOP－N1 on macrophage phagocytic function and the levels of NO and TNF－αwere estimated.Results The tumor weights of mice in WPOP－N1 low，medium and high doses groups were（2.38±0.55），（1.79±0.64），and（1.37±0.51）g，respectively，which were lower than that in normal control group（3.71 g±0.81 g）（P＜0.05）；the anti－tumor rates of WPOP－N1 low，medium and high doses groups were 35.8%，51.8%，and 63.1%；the serum TNF－αlevels of mice in WPOP－N1 medium and high doses groups were higher than that in normal control group（P＜0.05 or P＜0.01）；the phagocytic activities of peritoneal macrophages of mice in WPOP－N1 medium and high doses groups were higher than that in normal control group（P＜0.05 or P＜0.01）；the NO and TNF－αlevels secreted by murine peritoneal macrophages in WPOP－N1 low，medium and high doses groups were increased（P＜0.05）and had a dose－response.Conclusion WPOP－N1 has a significantly inhibitory effect on tumor in vivo and its mechanism may be related to activating macrophages to secrete NO and TNF－α，and enhancing the phagocytic activities of macrophages.

Pleurotus ostreatus；polysaccharide；immunomodulation；macrophage

R733

1671－587Ⅹ（2012）06－1091－05

2012－10－15

吉林省教育厅科研基金资助课题（2011－131，2012－171，2012－124）；吉林省科技厅青年基金资助课题（201201143）

孔繁利（1974－），男，吉林省四平市人，副教授，在读医学博士，主要从事肿瘤病理学研究。

李玉林（Tel：0431－85619481，E－mail：ylli＠mail.jlu.edu.cn）；孙新（Tel：0432－64608351，E－mail：sunxinbh＠126.com）