罗格列酮对帕金森病模型小鼠中脑黑质iNOS和IL－6表达的抑制作用及其意义

张 田，魏子峰，秦丽娟，周洪霞，张宇新

（1.河北联合大学基础医学院生理学教研室，河北 唐山063000；2.河北联合大学基础医学院解剖学教研室，河北 唐山063000）

罗格列酮对帕金森病模型小鼠中脑黑质iNOS和IL－6表达的抑制作用及其意义

张 田1，魏子峰2，秦丽娟1，周洪霞2，张宇新2

（1.河北联合大学基础医学院生理学教研室，河北 唐山063000；2.河北联合大学基础医学院解剖学教研室，河北 唐山063000）

目的：探讨罗格列酮对帕金森病（PD）模型小鼠中脑黑质中诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和白细胞介素－6（IL－6）的调控作用，并阐明其机制。方法：45只雄性小鼠随机分为对照组、模型组和罗格列酮处理组，每组15只。采用爬杆实验法观察各组小鼠行为学变化；采用免疫组织化学染色和Western blotting法观察小鼠中脑黑质酪氨酸羟化酶（TH）、iNOS和IL－6的表达。结果：模型组小鼠出现震颤、步态迟缓等PD样症状；小鼠转身（T－turn）及爬杆时间（T－LA）较对照组显著延长（P＜0.05）；黑质区TH阳性神经元缺失，炎症因子iNOS和IL－6阳性细胞明显增多，蛋白表达水平高于对照组（P＜0.05）；罗格列酮处理组小鼠PD样症状较模型组减轻，T－turn和T－LA少于模型组（P＜0.05），iNOS、IL－6和TH阳性细胞数及蛋白表达水平与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：罗格列酮可能通过抑制炎症因子iNOS和IL－6表达，对多巴胺能神经元起到保护作用。

帕金森病；酪氨酸羟化酶；诱导型一氧化氮合酶；白细胞介素－6；罗格列酮

目前，帕金森病（Parkinson’s disease，PD）的治疗多采用多巴胺（dopamine，DA）替代疗法，但DA替代疗法只能起到改善症状的作用，不能延缓疾病进程和多巴胺能神经元退变，长期应用DA可能会导致疾病恶化，因此急需找到其他有效的治疗药物。近年研究［1－2］显示：神经炎症可能是导致PD多巴胺能神经元丢失的重要因素，炎症因子引起了多巴胺能神经元变性丢失，因此抗炎治疗可能成为PD的重要治疗策略之一。罗格列酮是一种常用的治疗糖尿病药物，文献［3］报道：其在神经系统变性疾病中对神经元有保护作用，而罗格列酮对PD是否有治疗作用目前国内外尚无报道。为明确这一问题，本实验以1－甲基－4－苯基－1，2，3，6四氢吡啶（1－methyl－4－phenyl－1，2，3，6－tetrahyd － ropyridine，MPTP）制备PD小鼠模型，探讨罗格列酮能否可以减少PD模型小鼠黑质中诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）和白细胞介素－6（interleukin－6，IL－6）的表达，从而对多巴胺能神经元产生保护作用，以期为PD的治疗寻找新的途径。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要试剂 45只雄性健康C57BL／6N小鼠，12～14周龄，体质量25～30 g，清洁级，购于北京维通利华公司［SCXX（京）2002－2003］，小鼠均自由进食、饮水，在室温（25±2）°C单笼喂养。MPTP（Sigma公司，USA）；兔抗鼠iNOS单克隆抗体、UltraSensitive SP超敏试剂盒（福州迈新公司，中国）；兔抗大鼠IL－6单克隆抗体（Eptomics公司，USA）；预染蛋白 Marker（天津灏洋生物公司，中国）；大鼠抗TH单克隆抗体（Chemicon公司，USA）；罗格列酮（葛兰素史克公司，英国）。

1.2 动物分组及给药 小鼠随机分为模型组、罗格列酮处理组和对照组，每组15只。模型组：小鼠腹腔注射 MPTP（25 mg·kg－1，生理盐水溶解），每天1次，连续7 d；罗格列酮处理组：在MPTP注射前4 h给予小鼠罗格列酮灌胃预处理（4 mg·kg－1），每天1次，连续7 d；对照组：注射与模型组小鼠等量的生理盐水。

1.3 组织固定、取材和切片 MPTP第7次注射后12 h，每组随机取9只小鼠。小鼠腹腔麻醉后，经左心室插管用生理盐水（室温）灌注，再用4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液缓慢灌注固定，迅速切取小鼠中脑黑质部位脑块，置于4%多聚甲醛中固定48 h（4°C），固定好的脑组织经蒸馏水冲洗、梯度乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡和包埋处理，石蜡切片机做连续冠状切片，片厚5 m，4°C保存备用。每组15只小鼠中，随机取6只进行Western blotting分析。小鼠麻醉后，迅速断头取脑，分离小鼠中脑黑质部分，置入细胞裂解液中，低温匀浆，4°C震荡30 min后，12000 min－1、4°C离心15 min，取上清液，－80°C保存备用。

1.4 小鼠行为学检测 采用爬杆实验测定各组小鼠行为学改变。在MPTP注射7 d后，将1根长55.0 cm、直径0.8 cm的木杆上端缠以纱布以防止打滑，作为实验爬杆。测试时将被测小鼠头向上置于木杆顶端，分别记录小鼠转身时间（T－turn）和完全爬到杆底所需要的时间（T－LA）。每只小鼠测3次，取平均值。爬杆时间参数延长反应小鼠运动功能损害的程度。

1.5 免疫组织化学SP法检测各组小鼠酪氨酸羟化酶（TH）、iNOS和IL－6阳性神经元数量 切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水后，用TBS缓冲液p H（7.4±0.2）洗3次，每次5 min；组织切片进行水浴法抗原修复；降至室温；每张切片加入过氧化氢25μL，阻断内源性过氧化物酶；每张切片滴加10%正常山羊血清25μL，室温孵育15 min，同一组织相邻切片分别加入兔抗鼠iNOS单克隆抗体（1∶150）、兔抗大鼠IL－6单克隆抗体（1∶150）和大鼠抗TH单克隆抗体（1∶300），4°C过夜；加入二抗（生物素标记羊抗兔IgG，1∶150），室温孵育20 min；加入链霉菌抗生物素蛋白－过氧化酶溶液25μL，室温孵育20 min，DAB显色，自来水冲洗，苏木精复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜下观察。用多巴胺能神经元特异性标志酶TH判定模型小鼠黑质区多巴胺能神经元变化以及炎症因子iNOS和IL－6的表达变化。采用CMIAS真彩医学图像自动分析系统进行阳性细胞计数。各组每只动物取3张脑片，数值相加后取平均值。

1.6 免疫荧光组织化学染色法观察各组小鼠TH、iNOS和IL－6的表达部位 脑组织切片常规脱蜡至水后，PBS洗3次，每次15 min，正常非免疫动物血清室温孵育30 min，同一组织相邻切片分别加入兔抗鼠iNOS单克隆抗体（1∶100）与小鼠抗人TH单克隆抗体（1∶300）的一抗混合液和小鼠抗人TH单克隆抗体（1∶300）与兔抗大鼠IL－6单克隆抗体（Ser63，1∶100）的一抗混合液，4℃过夜，PBS振洗3次，每次15 min，加入异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）标记山羊抗兔IgG（1∶60）和四甲基若丹明异硫氰酸盐（tetramethyl rhodamine isothiocyanate，TRITC）标记山羊抗小鼠IgG（1∶100）荧光二抗混合液，37℃、60 min，PBS振洗3次，每次15 min，双蒸水振洗10 min，甘油缓冲液封片，荧光显微镜观察照相。绿色荧光为iNOS和IL－6表达，红色荧光为TH表达，橘黄色为双重荧光染色。

1.7 Western blotting法检测各组小鼠 TH、iNOS和IL－6蛋白表达量 蛋白定量后取4倍体积样品缓冲液，95℃变性10 min。蛋白上样量为每孔30 g，10%SDS－PAGE电泳，将蛋白电转移至硝酸纤维膜上，依相对分子质量大小切取条带，加入封闭液，室温下震荡2 h后，取相应条带分别加入兔抗鼠iNOS单克隆抗体（1∶300）、兔抗大鼠IL－6单克隆抗体（1∶200）和大鼠抗TH单克隆抗体（1∶400），4℃过夜。室温孵育1 h后分别加入二抗（生物素标记羊抗兔IgG，1∶500），室温孵育1 h；加入链霉菌抗生物素蛋白－过氧化酶溶液室温下孵育0.5 h；DAB显色，扫描蛋白印迹条带，作定量分析。

1.8 统计学分析 采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析。各组小鼠T－turn、T－LA、小鼠中脑黑质iNOS、IL－6和TH阳性细胞数及蛋白表达量以±s表示，组间比较采用单因素方差分析。

2 结 果

2.1 3组小鼠行为学表现 MPTP注射7 d后，模型组小鼠出现典型PD样症状，表现为竖毛、翘尾、震颤和运动变缓等特征。爬杆实验中，与对照组小鼠比较，模型组小鼠出现爬杆能力下降，爬杆所需时间显著延长。罗格列酮处理后，小鼠运动功能得到一定程度改善，表现为爬杆时间明显缩短。见表1。

表1 3组小鼠转身时间和爬杆时间的比较Tab.1 Comparisons the time of T－turn and T－LA between various groups （n＝9，±s，t／s）

表1 3组小鼠转身时间和爬杆时间的比较Tab.1 Comparisons the time of T－turn and T－LA between various groups （n＝9，±s，t／s）

＊P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs model group.

Group T－turn T－LA Control 2.2±0.6 5.3±1.5 Model 4.9±1.3＊ 13.8±3.7＊Rosiglitazone 3.1±0.9△ 7.7±2.8△

2.2 iNOS、IL－6和TH免疫荧光双重染色 模型组小鼠中脑黑质区可见TH免疫荧光单标记细胞为红色（图1 A和B，见插页二），iNOS和IL－6免疫荧光单标记细胞为绿色（图1 C和D，见插页二），融合图像可见橘黄色荧光，表明iNOS和IL－6与TH有部分共定位（图1 E和F，见插页二），黑质区大多数表达iNOS和IL－6的神经元均为多巴胺能神经元。

2.3 3组小鼠iNOS、IL－6和TH阳性细胞形态和数量 对照组小鼠中脑黑质区偶见iNOS和IL－6阳性细胞，第7次注射MPTP后12 h模型组小鼠中脑黑质区iNOS和IL－6阳性细胞显著增多，胞质呈棕黄色；罗格列酮处理组iNOS和IL－6阳性细胞较模型组减少。图像分析，模型组和罗格列酮处理组iNOS和IL－6阳性细胞数比较差异具有统计学意义（P＜0.05），见图2（插页三）和表2。对照组小鼠黑质区TH阳性神经元排列整齐密集，与对照组比较，模型组小鼠中脑黑质区TH阳性神经元大量丢失，罗格列酮处理组TH阳性神经元丢失程度明显减轻。模型组和罗格列酮处理组TH阳性细胞数比较差异具有统计学意义（P＜0.05），见图3（插页三）和表2。

2.4 3组小鼠IL－6、iNOS和TH蛋白表达水平免疫印迹，对照组小鼠中仅有微量IL－6、iNOS蛋白表达，模型组小鼠中IL－6、iNOS表达水平较对照组显著升高（P＜0.05）；罗格列酮处理组IL－6、iNOS蛋白表达水平较模型组明显下降（P＜0.05）；模型组 TH 表达较对 照组降低（P＜0.05），模型组和罗格列酮处理组TH表达量比较差异具有统计学意义（P＜0.05），而罗格列酮处理组与对照组IL－6、iNOS和TH表达量比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见图4和表3。

表2 3组小鼠中脑黑质iNOS、IL－6和TH阳性细胞数Tab.2 The numbers of iNOS，IL－6 and TH positive cells in the substantia nigra of the midbrain of mice in three groups（n＝9，±s）

表2 3组小鼠中脑黑质iNOS、IL－6和TH阳性细胞数Tab.2 The numbers of iNOS，IL－6 and TH positive cells in the substantia nigra of the midbrain of mice in three groups（n＝9，±s）

＊P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs model group.

Group iNOS IL－6 TH Control 1.45±0.541.33±0.29140.29±8.75 Model 37.35±6.43＊ 36.45±4.70＊ 85.21±6.31＊Rosiglitazone 8.43±1.19△ 9.13±1.69△ 117.43±7.33△

图4 3组小鼠中脑黑质IL－6、iNOS和TH蛋白表达电泳图Fig.4 Electrophoregram of expressions of IL－6，iNOS and TH in the substantia nigra of the midbrain of mice in three groups

表3 3组小鼠中脑黑质IL－6、iNOS和TH蛋白表达水平Tab.3 Expression levels of IL－6，iNOS and TH in the substantia nigra of the midbrain of mice in three groups（n＝9，±s）

表3 3组小鼠中脑黑质IL－6、iNOS和TH蛋白表达水平Tab.3 Expression levels of IL－6，iNOS and TH in the substantia nigra of the midbrain of mice in three groups（n＝9，±s）

＊P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs model group.

Group IL－6 iNOS TH Control 4.24±0.282.17±0.2419.78±3.13 Model 26.33±3.01＊ 25.32±3.98＊ 11.89±1.47＊Rosiglitazone 7.28±1.42△ 9.10±1.35△ 16.14±1.32△

3 讨 论

PD是一种常见于中老年人中枢神经系统的退变性疾病，主要病理特征为黑质致密部多巴胺能神经元进行性变性丢失，使黑质－纹状体通路DA释放减少，从而出现静止性震颤、肌肉强直和运动迟缓等临床症状。尽管目前PD的发病机制仍不是十分清楚，但越来越多的证据［4］表明：炎症反应可能在PD 发病中起重要作用。研究［5－7］显示：应用MPTP、6－羟 多 巴 胺（6－hydroxydopamine，6－OHDA）和鱼藤酮建立PD动物模型，能显著刺激炎症因子如iNOS和IL－6的表达，造成多巴胺能神经元变性丢失。国外学者研究［8］发现：在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）建立的PD体外模型中，抑制iNOS和IL－6表达，可对多巴胺能神经元起到保护作用。另有研究［9］显示：PD患者中脑黑质区变性神经元周围炎症因子水平显著升高。本实验采用MPTP制备PD小鼠模型，于MPTP注射后第7天观察小鼠黑质区炎症因子iNOS和IL－6蛋白表达和TH神经元丢失情况，结果显示：模型组小鼠黑质区TH阳性神经元丢失明显，同时伴有炎症因子iNOS和IL－6大量表达，而对照组小鼠未出现上述变化，Western blotting检测结果也显示了同样趋势。免疫荧光双标记检测结果显示：iNOS、IL－6和TH神经元存在共定位。上述现象表明：多巴胺能神经元丢失可能与炎症反应存在密切联系。

目前，PD的治疗仍然是控制症状为主。左旋多巴是治疗PD的首选药物，但其并不能阻止PD的病程进展，而且长期服用会产生严重的副作用。越来越多的研究［10］显示：炎症反应可能在PD发病中起了重要作用，因此抗炎治疗有望成为治疗PD的重要手段之一。米诺霉素能有效地降低炎症反应，在PD治疗中已取得了较好疗效。国外学者研究［11］发现：罗格列酮可减少神经系统损伤疾病中神经元的丢失，对神经元起到保护作用。最近文献［12］报道：在 MPTP所致PD慢性动物模型中，罗格列酮可以减少小胶质细胞PPAR－γ表达，减轻多巴胺能神经元变性丢失。本研究结果显示：与模型组小鼠比较，罗格列酮处理组小鼠中脑黑质区iNOS和IL－6阳性细胞大幅减少，蛋白水平亦下降，同时TH阳性神经元丢失程度得到明显减轻。由于MPTP选择性破坏黑质多巴胺能神经元，导致黑质细胞体、纹状体神经末梢DA递质大量减少，从而出现PD样症状。本实验采用爬杆试验对小鼠运动功能进行动态评估［13］结果显示：模型组小鼠产生类似PD样症状体征，肢体协调能力差，表现为爬杆所需时间延长，经罗格列酮处理后运动功能增强，爬杆时间明显缩短。

综上所述，在本实验条件下，MPTP可诱导模型小鼠中脑黑质炎症介质iNOS和IL－6的高表达，多巴胺能神经元显著丢失；罗格列酮可抑制iNOS和IL－6表达，使多巴胺能神经元变性丢失现象有所减轻，从而发挥一定的神经保护作用。

［1］Tian L，Zhang S，Xu L，et al.Selenite benefits embryonic stem cells therapy in the animal models of Parkinson’s disease through inhibiting inflammation［J］. Mol Neurodegener，2012，7（Suppl 1）：L25.

［2］Collins LM，Toulouse A，Connor TJ，et al.Contributions of central and systemic inflammation to the pathophysiology of Parkinson’s disease［J］. Neuropharmacology，2012，62（7）：2153－2167.

［3］Escribano L，Simón AM，Gimeno E，et al.Rosiglitazone rescues memory impairment in Alzheimer’s transgenic mice：mechanisms involving a reduced amyloid and tau pathology［J］.Neuropsychopharmacology，2010，35（7）：1593－1604.

［4］Garrido－Gil P，Joglar B， Rodriguez－Perez AI， et al.Involvement of PPAR－γ in the neuroprotective and antiinflammatory effects of angiotensin type 1 receptor inhibition：effects of the receptor antagonist telmisartan and receptor deletion in a mouse MPTP model of Parkinson’s disease［J］.J Neuroinflammation，2012，9：38.

［5］Broom L，Marinova－Mutafchieva L，Sadeghian M，et al.Neuroprotection by the selective iNOS inhibitor GW274150 in a model of Parkinson’s disease［J］.Free Radic Biol Med，2011，50（5）：633－640.

［6］Tsai SJ，Chao CY， Yin MC，et al.Preventive and therapeutic effects of caffeic acid against inflammatory injury in striatum of MPTP－treated mice［J］.Eur J Pharmacol，2011，670（2／3）：441－447.

［7］Hernández－Romero MC，Delgado－Cortés MJ，Sarmiento M，et al.Peripheral inflammation increases the deleterious effect of Cns inflammation on the nigrostriatal dopaminergic system［J］.Neurotoxicology，2012，33（3）：347－360.

［8］Kim IS，Ko HM，Koppula S，et al.Protective effect of Chrysanthemum indicum Linne against 1－methyl－4－phenylpridinium ion and lipopolysaccharide－induced cytotoxicity in cellular model of Parkinson’s disease［J］.Food Chem Toxicol，2011，49（4）：963－973.

［9］Tansey MG， Goldberg MS. Neuroinflammation in Parkinson’s disease：its role in neuronal death and implications for therapeutic intervention［J］.Neurobiol Dis，2010，37（3）：510－518.

［10］Fan L，Wang TL，Xu YC，et al.Minocycline may be useful to prevent／treat postoperative cognitive decline in elderly patients［J］.Med Hypotheses，2011，76（5）：733－736.

［11］Verma R，Mishra V，Gupta K，et al.Neuroprotection by rosiglitazone in transient focal cerebral ischemia might not be mediated by glutamate transporter－1［J］.J Neurosci Res，2011，89（11）：1849－1858.

［12］Carta AR，Frau L，Pisanu A，et al.Rosiglitazone decreases peroxisome proliferator receptor－gamma levels in microglia and inhibits TNF－alpha production： new evidences on neuroprotection in a progressive Parkinson’s disease model［J］.Neuroscience，2011，194：250－261.

［13］Yacoubian TA，Standaert DG.Targets for neuroprotection in Parkinson’s disease［J］.Biochem Biophys Acta，2009，1792（7）：676－687.

Inhibitory effects of rosiglitazone on expressions of iNOS and IL－6 in substantia nigra of mice with Parkinson’s disease and their significances

ZHANG Tian1，WEI Zi－feng2，QIN Li－juan1，ZHOU Hong－xia2，ZHANG Yu－xin2
（1.Department of Physiology，School of Basic Medical Sciences，Hebei United University，Tangshan 063000，China；2.Department of Anatomy，School of Basic Medical Science，Hebei United University，Tangshan 063000，China）

Objective To investigate the regulation of rosiglitazone on iNOS and IL－6 in substantia nigra of the mice with Parkinson’s disease（PD），and to clarify the mechanism.Methods 45 male mice were randomly divided into control group（n＝15），model group（n＝15）and rosiglitazone group（n＝15）.The behavioral changes of the mice in various groups were observed by pole climbing experiment；immunohistochemistry and Western blotting methods were used to observe the expressions of iNOS，IL－6 and TH in substantia nigra of the mice.Results The model mice exhibited typical PD－like behaviors，such as tremor，gait retardation；compared with control group，the time of T－turn and T－LA in model group was prolonged，the differences between two groups were significant（P＜0.05）；Compared with control group，TH－positive neurons lost obviously，the numbers of iNOS，IL－6 and TH immunoreactive cells and the expression levels in substantia nigra of the midbrain were increased markedly，and the differences were statistically significant（P＜0.05）.After treated with rosiglitazone，the changes mentioned above were reduced significantly；there were significant differences of the numbers of iNOS，IL－6 and TH positive cells and their protein expression levels compared with model group（P＜0.05）.Conclusion Rosiglitazone may protect the dopaminergic neurons by inhibiting the expressions of iNOS and IL－6.

Parkinson’s disease；tyrosine hydroxylase；inducible nitric oxide synthase；interleukin－6；rosiglitazone

R745

A

1671－587Ⅹ（2012）06－1124－05

2012－05－20

河北省科技厅自然科学基金资助课题（C2004000689）；河北省博士基金资助课题（05547008D－4）；河北省科学技术与社会发展计划项目资助课题（04276135）；河北省唐山市科学技术研究与发展计划项目资助课题（10140201A－15）

张 田（1979－），女，河北省唐山市人，讲师，医学硕士，主要从事帕金森病病因与发病机制的研究。

张宇新（Tel：0315－3726421，E－mail：jpzyx＠163.com）