野生侧耳分子鉴定及生物栽培转化技术的研究

杨春成，覃 雯，武 琳，尹立伟*

（1.皖西南生物多样性研究与保护安徽省重点实验室，安庆师范大学 生命科学学院，安徽 安庆 246133；2.安徽省功能配合物重点实验室，安庆师范大学 化学化工学院，安徽 安庆 246133）

糙皮侧耳（Pleurotus ostreatus），又名侧耳、平菇、蚝菇、黑牡丹菇，在台湾又称之为秀珍菇，其分类学地位是真菌界下的担子菌亚门侧耳科侧耳属[1-3]。糙皮侧耳是一种常见的食药用菌，营养价值较高，含有蛋白多糖、甾类化合物、微量元素、氨基酸等多种成分，具备消炎、抗肿瘤、免疫调理、调节妇女更年期综合征、改善人体新陈代谢等多种药理功能，在我国栽培历史悠久、栽培面积广[4-7]。王丽宁等研究发现糙皮侧耳中过氧化氢酶CAT参与真菌胁迫响应和发育过程的遗传变异、基因结构及进化地位[8]。侯志浩通过生物信息学方法鉴定了糙皮侧耳中Zn2Cys6型锌指转录因子家族成员（PoZCPs），并对其参与热胁迫和子实体发育的家族成员PoZCP26功能及其下游基因调控机理进行了分析研究[9]。马倩倩利用糙皮侧耳粗酶液中的漆酶对7种不同结构类型的染料进行了脱色研究，发现漆酶对蒽醌类和苯甲烷类染料脱色显著，对苯胺类和杂环类染料脱色良好，对偶氮染料脱色效果差[10]。

糙皮侧耳已成为我国大宗蔬菜品种之一，市场需求量大、种植量多、栽培原料来源广泛，以其为主要原料的休闲食品、保健品等精加工产品有巨大的发展潜力，是我国乡村脱贫致富的“小、易、速”事业[11]。野生侧耳已濒临灭绝，种植侧耳存在转代次数多，朵形、味道差，产量不高，食用后功效不理想，栽培技术落后、污染大、风险高等问题。安徽省安庆市地属亚热带季风性气候，冬暖夏热、气候湿润，适宜野生真菌室内栽种。本文以野生侧耳属菌株为实验材料，探究侧耳室内生物栽培转化技术与管理体系，为当地大棚栽培糙皮侧耳提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 菌种来源

野生侧耳PO1（WildP.ostreatus）于2019年2月采摘自安徽省安庆市安庆师范大学龙山校区某樟树上，分离鉴定后于4°C保存在生命科学学院动植物检验检疫实验室，同时，栽培转化的糙皮侧耳PO2培养于学院食药用菌栽培研究室G503。武汉平菇侧耳（P.ostreatus）于2019年5月购自武汉市周玉麟食用菌研究所。

1.2 培养基配制

母种PDA 培养基：马铃薯100 g、葡萄糖10 g、琼脂10 g、蒸馏水补足500 ml，装试分管，121°C 灭菌30 min后摆斜面[12]。

原种棉籽壳培养基：棉籽壳90%，麸皮4.5%，玉米粉4.5%，石膏粉1%，加水混合至约65%，pH 为5.5～6.5，配制10 kg的玻璃瓶原种培养基。

栽培种木屑培养基：杂木屑78%、麸皮或米糠20%、石膏粉1%、蔗糖1%、加水混合至50%～60%，装制栽培料时达到手握料有水但不滴出为宜，pH为6.5左右，配制100 kg的塑料袋栽培种培养基，最后制成侧耳菌袋[13-15]。

1.3 野生侧耳形态学及分子生物学鉴定

对野生侧耳培养特性进行观察，将载玻片45°倾斜插入生长7～9 d菌种的培养基中，室温培育12 h后取出，观察侧耳菌丝的形成、色泽、构造以及是否有分隔等宏观和微观生长特性。采用细胞破壁仪充分研磨至破壁，利用真菌试剂盒（UNIQ-10柱式）提取总DNA，获得侧耳基因组DNA。最后，取2 μl溶液进行琼脂糖凝胶电泳，检测DNA样品纯度。以野生侧耳基因组DNA 为模板进行PCR 扩增，反应体系为25 μl，采用真菌通用引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）。PCR 反应条件：94°C 预变性5 min，94°C 变性30 s，55°C 退火45 s，72°C 延伸2 min，共35个循环，最后72°C延伸10 min，终止温度4°C。通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并测序。在NCBI中提交侧耳菌株PO1的ITS序列，对相似菌种ITS序列进行BLAST比对，并利用ClustalW 2.0软件进行序列质检，最后，采用MEGA 6.1软件的NJ 法构建系统发育树[16-17]。

1.4 侧耳的室内栽培管理

糙皮侧耳栽培采用熟料与生料两种培养方式，各培养200 袋，室内培养2 个月，侧耳菌丝体的生长温度以（22～28）°C为宜，子实体在（5～24）°C之间均能分化且出菇以（85～95）%的空气相对湿度为宜。侧耳菌种的转接需在接种箱内操作，发菌时转至灭菌室避光培养，侧耳菌丝在暗环境下长满整袋后搬到出菇室出菇，子实体生长发育只需散射光。优质原种和栽培种菌龄以（20～25）d为宜，侧耳原基分化和子实体生长发育阶段的严格管理是侧耳高产的关键。侧耳原基形成期时，应增加照射强度和照射时间、环境相对湿度和空气更替，并将温度降至17°C左右，扩大昼夜温差以加快原基形成。在桑葚期要保持充足的相对湿度，可向环境中喷洒水雾，应避免直接往培养料洒水。菇柄长短与种类和环境条件有关，要做好室内温/湿度、通风及散射光的管理工作。在菌盖生长期，温度28°C为宜，相对湿度应在87%以上。菌盖处于基本展开状态，长达（8～10）cm，菌肉肥美，氨基酸含量高，颜色由深灰色变为淡灰色或灰白色，孢子尚未弹射，此时采摘最为合适观察，采收时不论大小，一次采完，留下小的菇蕾待发菌培养二潮菌菇[18]。

2 结果与分析

2.1 野生侧耳的生物学特性

野生侧耳母种培养采用PDA 培养基，培养（8～10）d 后菌丝可长满平皿。生长（3～7）d 的初生菌丝，如图1A～B所示，侧耳菌丝粗壮整齐、洁白浓密、呈匍匐绒毛状、多分枝、有横隔，菌丝生长旺盛，菌苔浓白；气生菌丝爬壁力强；菌丝长满斜面时，子实体原基尚未分化，培养基未收缩，无杂菌；单核菌丝较纤细。在10～20倍显微镜下观察发现，糙皮侧耳二级菌丝粗壮，爬壁能力强，双核菌丝有锁状联合现象，如图1C～D所示。

图1 糙皮侧耳的生物学培养特性

2.2 野生侧耳PCR扩增结果与系统发育分析

对野生侧耳菌株PO1的ITS区域进行扩增，获得了636 bp的核苷酸序列，将该序列提交到GenBank（登录号为MT261808.1），见图2 所示，ITS1 序列红色区段是（1～217）bp，5.8S rDNA 序列蓝色区段是（218～410）bp；ITS2 序列黄色区段是（411～574）bp，28S 序列黑色区段是（575～636）bp。将菌株PO1与100个同源菌株进行对比，证明PO1与其他54株侧耳（P.ostreatus）菌株亲缘关系较为密切，ITS序列最小覆盖率超过98%，且相似性达99.0%，与30株佛州侧耳（Pleurotus florida）覆盖率也为97%以上，与2株杏鲍菇（Pleurotus eryngii）相似性分别达99.2%和99.8%，与3株美味侧耳（Pleurotus sapidus）最小相似性为99.4%，与1株大伏革菌（Phlebiopsis gigantea）相似性为99.7%，与1株鲍鱼菇（Abalone mushroom）的覆盖率为97%，与其他9株侧耳属菌株的相似性超过98.6%。

图2 野生侧耳PO1的I TS序列分析

利用MEGA6.1软件的NJ聚类法构建出侧耳属的不同菌株间的系统发育树，如图3 所示，菌株PO1（※表示野生侧耳PO1）与5 株糙皮侧耳菌株最为亲密，与4 株佛州侧耳（P.florida）关系紧密，与3株美味侧耳（P.sapidus）、2 株杏鲍菇（P.eryngii）、1株鲍鱼菇（P.abalonus）、1 株大伏革菌（P.gigantea）的遗传距离也较接近。选取侧耳属的3株金顶侧耳（P.citrinopileatus），2株白阿魏侧耳（P.nebrodensis），2株肺形侧耳（P.pulmonarius），4 株白黄侧耳（P.cornucopiae），它们之间的亲缘关系最为接近。另外，还选取了1 株草菇（Volvariella volvacea）作为另一组群，虽然侧耳与草菇同属伞菌目，但草菇为小包脚菇属的小包脚菇（V.volvacea），而侧耳属于侧耳科侧耳属，两者在遗传距离上较远。系统发育树揭示了野生侧耳PO1不是外源种，与草菇有区别，分子鉴定菌株PO1为糙皮侧耳。

图3 侧耳属不同菌株的系统发育树构建

2.3 糙皮侧耳生物栽培转化结果

糙皮侧耳采用熟料与生料2种培养方式，菌丝生长需2个月，在温/湿度以及光线等环境条件严格管控下，菌丝生长速度分别为0.433 cm/d和0.405 cm/d，结合优化的栽培种培养基配料，熟料采用高温高压方式，灭菌5 h 以上，萌发24 d 的菌丝发菌率可达99%以上，而未灭菌生料26.5 d 的菌丝发菌率仅为68%，且栽培过程易出现绿色霉菌。试验表明，添加1:1 000克霉灵，并进行高温高压灭菌、室内消毒等操作，可以防止在栽种过程中产生其他杂菌。重要的是，在拌料过程中水分不均匀会导致后期发菌过程菌袋内湿度大，从而易出现黄色霉菌；在灭菌过程中部分菌袋会破裂，后期亦出现绿霉；培养料的处理方式也会明显影响侧耳生长。本次熟料栽培的糙皮侧耳生物转化率为158%，而生料栽培的生物转化率为143%。珊瑚期半球状长成菇蕾，并继续伸长形成菇柄，当有大量孢子散发时，侧耳质量已变差，如图4A～C所示。与野生侧耳PO1和武汉平菇侧耳相比，生物栽培转化的糙皮侧耳PO2 朵型丰满、颜色灰白、整齐规则、产量高，如图4D～E所示。采收后放入双孔透气一次性采收盒。一周后继续喷水，仍按第一批出菇的种植采收程序进行管理。按侧耳菇市场均价6元/kg计算，本次栽培侧耳收益约800 元，三潮菇从产量和品质上都不及头潮菇和二潮菇，尤其是口感木质化严重。侧耳成熟后潮次明显，每批侧耳收获后料面均需清洗整理，并停水继续养菌。

图4 野生侧耳PO1、武汉平菇侧耳与糙皮侧耳PO2子实体对比

3 结论与讨论

安庆师范大学龙山校区的校园生境适宜野生侧耳的生长，从枯死樟树上发现了大型真菌的存在，这种野生菌可在离体和人工培养基上进行分离纯化。将纯培养菌丝接种到含有相同培养基质的栽培料可以获得相同的野生菌培养物，并得到与接种物相同的性状。基于侧耳ITS序列系统发育分析，PO1与5株侧耳P.ostreatus（P8、NW449、TNAUCBE1、B2SN043和Tianda300）亲缘关系最为接近。野生菌PO1与生物栽培转化的PO2同源性高达99.9%，表明其菌丝具备稳定遗传的生物学特性。宋立志基于ITS序列对侧耳属进行了分子鉴定及系统发育学分析，研究结果为进一步筛选优良菌种、优化母种，提高生产量提供了重要参考信息[19]。王强等通过测定7 个侧耳属木质纤维素酶活性发现，平菇菌株漆酶活性可达189.11 U/mL，而纤维素酶活性可达31.60 U/mL，该研究揭示了侧耳是木腐菌，具有降解木质纤维素的功能[20]。侧耳栽培多以木屑等为主原料，对木屑降解的速率及程度将直接影响侧耳子实体的生长大小、快慢和周期。赵光辉等概述了平菇人工栽培中生料、熟料、发酵料、发酵-半熟料等4 种栽培模式的优缺点[21-22]，为种植户提供了侧耳的栽培管理技术。

侧耳栽培过程通常要处于暗环境条件下，温度28°C左右、湿度80%以上、适宜的栽培料配比等都是提高侧耳产量的重要条件，在人工栽培时需根据菌种综合考虑。新鲜糙皮侧耳PO2子实体长势水润脆嫩、肥厚、朵型大、抗性强、产量高。王永斌[23]发现平菇黑平王品种的总生物转化率为100%以上，而本研究的生物转化率高达158%，经过栽培转化的糙皮侧耳PO2产量要高于市售平菇侧耳产量，提高了生物栽培转化产能，达到高产目的，可以开展大棚种植，为农民大棚栽培管理技术提供了参考依据。