微波消解皂化HPLC法测定熏制食品中的PAHs

黄东萍，陆叶，黄明立，蒋贵发

（广西医科大学公共卫生学院，广西 南宁 530021）

微波消解皂化HPLC法测定熏制食品中的PAHs

黄东萍，陆叶，黄明立，蒋贵发

（广西医科大学公共卫生学院，广西 南宁 530021）

利用微波消解皂化熏肉、熏鱼和熏肠3种熏制食品，并经萃取、净化、浓缩后用SUPELCOSIL LC-PAH色谱柱进行分离，采用梯度洗脱方法，用紫外检测器检测，从而建立微波消解皂化前处理法高效液相色谱检测熏制食品中多环芳烃（PAHs）的方法。结果表明，微波消解在0.5 MPa压力下加热5 min可以取得较好的皂化效果，梯度洗脱能有效分离16种PAHs，各组分校正曲线线性关系良好，相关系数在0.9937～0.9995之间，加标回收率为52.36%～118.39%，精密度变异系数为2.29%～10.13%。

微波消解皂化；高效液相色谱（HPLC）；多环芳烃；熏制食品

多环芳烃（Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是一组由2个或2个以上苯环稠和在一起的芳香族化合物及其衍生物，目前已知的有200多种。PAHs广泛存在于环境中，烟熏肉制品中的多环芳烃主要是食品与燃料产物直接接触、脂肪焦化与裂解、蛋白质高温分解与糖不完全燃烧等因素产生的[1]。PAHs具有较强致癌作用，它可通过皮肤、呼吸道及食品进入人体，在芳烃羟化酶的作用下代谢活化为多环芳烃环氧化物，与DNA、RNA和蛋白质等生物大分子结合而诱发突变和肿瘤[2]。因此控制食品特别是熏、炸、腌、腊肉制品中的PAHs，减少其对人体的危害是很有必要的。目前肉制品中多环芳烃的前处理方法有索氏提取法、超声波萃取、固相萃取和加速溶剂萃取[3]，而微波消解皂化熏肉制品的前处理方法鲜见报道。为了加快PHAs的检测速度，更好地控制PHAs，本文对熏肉、熏鱼和熏肠3种熏制食品的样品前处理和PAHs检测方法进行了摸索。

1 仪器与材料

1.1 仪器

LC-10ATVP高效液相色谱仪：日本岛津公司；光纤压力自控密闭微波消解系统：上海新科微波溶样测试技术研究所；GSY-11电热恒温水浴锅：北京市医疗设备厂；BS11OS电子天平：北京赛多利斯天平有限公司；0.45 μm 滤膜。

1.2 材料与试剂

市购熏肉、熏鱼、熏肠；

乙腈：色谱纯，美国TEDIA公司；超纯水：法国MILLIPORE超纯水器制造；甲醇、石油醚、浓硫酸、氢氧化钾、氯化钠、无水硫酸钠均为国产分析纯。

EPA61016种多环芳烃混标：100μg/mL～2000μg/mL，美国SUPELCO公司，甲醇-二氯乙烷1:1。

16 种 PAHs组分及含量如下：苊（1000 μg/mL）、苊烯（2000μg/mL）、蒽（100μg/mL）、苯并（a）蒽（100μg/mL）、苯并（a）芘（100 μg/mL）、苯并（b）荧蒽（200 μg/mL）、苯并（g，h，i）芘（200 μg/mL）、苯并（k）荧蒽（100 μg/mL）、屈（100 μg/mL）、茚并（a，h）蒽（200 μg/mL）、荧蒽（200 μg/mL）、芴（200 μg/mL）、茚 并（1，2，3－cd）芘（100 μg/mL）、萘（1000 μg/mL）、菲（100 μg/mL）、芘（100 μg/mL）。

2 方法

2.1 色谱条件

SUPELCOSIL LC-PAH 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相A：纯乙腈，流动相B：超纯水；梯度洗脱程序：0 min～5 min，A 保持 40%；5 min～30 min，A 由40%线性增加至100%；30 min～40 min，A维持100%；流速：1.5 mL/min；柱温：35 ℃；进样：10 μL；紫外检测波长：254 nm。

2.2 标准溶液的制备

PAHs混合储备液的制备：精密吸取0.5 mL PAHs混标（100 μg/mL～2000 μg/mL）至10 mL 棕色容量瓶中，乙腈定容即得PAHs混合储备液（5μg/mL～100μg/mL）。

PAHs混合标准系列溶液的制备：精密吸取PAHs混合储备液5.0 mL于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容至刻度，混匀，制成PAHs标准使用液（2.5 μg/mL～50 μg/mL）；从PAHs标准使用液中精密吸取 0.10、0.20、0.40、0.80、1.20、1.60 mL 至 6 个 10 mL 棕色容量瓶中，分别用乙腈定容即得PAHs混合标准系列溶液（0.025 μg/mL～0.5 μg/mL、0.05 μg/mL～1 μg/mL、0.1 μg/mL～2 μg/mL、0.2 μg/mL～4 μg/mL、0.3 μg/mL～6 μg/mL、0.4 μg/mL～8 μg/mL）。

2.3 样品前处理及测定

称取一定量样品，用食品搅拌机搅碎、混匀；分别准确称取样品1g3份，置于3个溶样杯中，加入10.0mL KOH甲醇溶液（1 mol/L），盖好活塞，置于试样罐中，在微波消解系统中以0.5 MPa压力加热5 min进行皂化，自然冷却至常温。将皂化液过滤后合并移入125 mL分液漏斗中，用10 mL蒸馏水分两次洗溶样杯，合并洗液于分液漏斗中，分别用20mL石油醚提取皂化液3次，合并提取液。向萃取液中缓慢滴加6 mL浓硫酸，轻轻振荡后静置分层，弃去磺化层，用30 mL 50 g/L氯化钠溶液洗2次，最后加入8 g无水硫酸钠脱水、过滤，置于恒温水浴锅内蒸干，用少量甲醇溶解残渣后转移至10 mL容量瓶中，定容得样品提取浓缩液。样品提取浓缩液经0.45 μm滤膜过滤，取10 μL注入高效液相色谱仪测定，根据校正曲线计算各组分含量。

3 结果与讨论

3.1 皂化方法的选择

在摸索微波消解皂化条件时，选择了在0.5、1 MPa压力下各皂化3、5、7 min，结果发现3 min时皂化不完全，1 MPa压力及7 min条件下出现了溶剂泄漏，因此本试验采用0.5 MPa与5 min作为的皂化压力与皂化时间。与其他前处理方法相比，微波消解皂化彻底且耗时很短，适合于含大量脂肪的肉类食品中多环芳烃的快速测定。

3.2 校正曲线与方法检出限

在选定的试验条件下，16种PAHs分离效果良好，如图1所示。

图1 PAHs混合标准溶液图谱Fig.1 Chromatograph mix standard PAHs

以峰面积为横坐标，各组分浓度为纵坐标得到相应的校正曲线结果见表1。

由表1可见，所有校正曲线方程的相关系数均在0.9937～0.9995之间，表明其具有良好的线性关系，以信噪比为3计算各PAH的检出限结果见表1。

表1 校正曲线及方法的检出限Table 1 Correction curve and detection limit

续表1 校正曲线及方法的检出限Continue table 1 Correction curve and detection limit

3.3 方法回收率与精密度

将已知含量的熏肉分为2组，准确称取后，分别加入 0.05 μg/mL～1 μg/mL 和 0.2 μg/mL～4 μg/mL 的 PAHs混合标准溶液各1.0 mL作为高低浓度组，按样品前处理和测定方法进行测定，每组做6个平行样。加标回收测定结果及精密度见表2。

表2 PAHs加标回收率与精密度（n=6）Table 2 PAHs recovery and precision test(n=6)

结果显示低浓度组PAHs的加标回收率在65.35%～101.09%之间，平均回收率为87.32%，RSD在4.36%～8.35%之间，平均RSD为6.49%；高浓度组PAHs的加标回收率在66.31%～96.29%之间，平均回收率为87.71%，RSD在3.78%～8.66%之间，平均RSD为6.61%。表明方法回收率与精密度均良好。

3.4 样品的测定结果

3类熏制食品中均检测出PAHs，其中熏肉中检出13种，熏鱼中检出12种，熏肠中检出13种。各样品PAHs的含量见表3。

表3 样品中多环芳烃含量Table 3 Contents of PAHs in sample μg/kg

续表3 样品中多环芳烃含量Continue table 3 Contents of PAHs in sample μg/kg

3类样品中均不同程度地含有致癌物[4]，特强致癌物苯并（a）芘和茚并（a，h）蒽、强致癌物苯并（b）荧蒽和苯并（k）荧蒽在3类熏制食品中均被检出且在部分样品中含量比较高；致癌物苯并（a）蒽和弱致癌物屈在3类熏制食品中均被检出。熏肠样品图谱，见图2。

图2 熏肠样品图谱Fig.2 Chromatograph of smoked sausage

4 结论

本次实验的结果显示：使用微波消解在0.5 MPa压力下加热5 min可以取得较好的皂化效果；高效液相色谱分离过程中使用梯度洗脱能有效分离16种PAHs，各组分校正曲线线性关系良好，相关系数在0.9937～0.9995之间，加标回收率为52.36%～118.39%，精密度变异系数为2.29%～10.13%。说明本文使用微波消解的皂化方法处理样品简便快捷，净化效果好，与高效液相色谱法方法联用能同时测定16种PAHs，回收率和精密度均符合要求，适合熏制食品中PAHs的含量测定。

在本次实验中发现部分样品除苯并（a）芘含量较高外，其他致癌性PAHs含量也较高。2008年欧洲食品安全局提出食品中的PAHs不应单独以苯并（a）芘作为控制指标，而应以PHA2、PHA4或PHA8来衡量PHAs的基因毒性和致癌性会更加有效[5-6]。PHA2是指苯并（a）芘和屈2种PAHs含量总和，PHA4是指苯并（a）芘、屈、苯并（a）蒽和苯并（b）荧蒽 4种 PAHs含量总和，PHA8是指苯并（a）芘、屈、苯并（a）蒽、苯并（b）荧蒽、苯并（k）荧蒽、苯并（g，h，i）芘、茚并（a，h）蒽和茚并（1，2，3－cd）芘 8种 PAHs含量总和。笔者比较赞成以PHA8作为PHAs的控制指标，也建议相关部门提高食品中PHAs的卫生标准，以更好地保障人们的食品安全。

[1]崔国梅,彭增起,孟晓霞.烟熏肉制品中多环芳烃的来源及控制方法[J].食品研究与开发,2010,31(3):180-183

[2]孙长颢.营养与食品卫生学[M].北京:人民卫生出版社,2007:312-313

[3]万红丽,周光宏,徐幸莲,等.肉制品中多环芳烃前处理技术的研究进展[J].食品研究与开发,2006,27(8):124-126

[4]岳敏,谷学新,邹洪,等.多环芳烃的危害与防治[J].首都师范大学学报:自然科学版,2003,24(3):40-44

[5]European Commission.Regulation(EC)No 208/2005 of 4 February 2005 amending Regulation(EC)No 466/2001 as regards polycyclic aromatic hydrocarbons[Z].Official journal of the european community,2005,L 34:3-5

[6]EFSA.Scientific opinion of the panel on contaminants in the food chain on a request from the European Commission on Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in Food[Z].The EFSA Journal,2008:724

Determination of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in Smoked Foods by Microwave Digestion Saponification and HPLC

HUANG Dong-ping,LU Ye,HUANG Ming-li,JIANG Gui-fa
(Public Health School of Guangxi Medical University,Nanning 530021,Guangxi,China)

Three kinds of sample such as smoked meat,fish and sausage,were saponified by microwave digestion.Polycyclic aromatic hydrocarbons(PAHs)in them were extracted,purified,condensed and separated by SUPELCOSIL LC-PAH column.Thus the method for determination of PAHs in smoked foods by microwavedigestion-saponification pre-treatment and HPLC was established.The result showed microwave digestion which was carry out with 0.5 MPa for 5 min could obtain better extraction efficiencies.The component of 16 PHAs were divided completely by the column in combination of a gradient elution.The linear relation of correction curve for all components was good.The correlation coefficient of PAHs ranged from 0.9937 to 0.9995.The recoveries were between 52.36%-118.39%.The RSD of precision varied between 2.29%-10.13%.

microwave digestion saponification;HPLC;PAHs;smoked foods

广西青年科学基金（桂科青0832048）

黄东萍（1971—），女（汉），副教授，硕士研究生，研究方向：色谱分析。

2011-12-23