6种食用菌菌丝体多糖含量的比较

熊芳，孙淑静，肖颖，胡开辉

（福建农林大学生命科学学院，福建 福州 350002）

6种食用菌菌丝体多糖含量的比较

熊芳，孙淑静，肖颖，胡开辉*

（福建农林大学生命科学学院，福建 福州 350002）

以热水浸提的方法分别从香菇、凤尾菇、金针菇、秀珍菇、茶树菇、赤芝的菌丝体中提取多糖，并用苯酚-硫酸法对多糖含量进行测定。结果表明,这6种食用菌菌丝体的多糖含量分别为，4.84%、3.45%、7.72%、3.14%、11.18%和5.22%。同时通过对羟自由基清除能力的测定对这6种多糖进行抗氧化活性研究，结果表明,虽然茶树菇多糖含量最高，但其清除羟自由基的能力最弱；凤尾菇和秀珍菇的多糖含量相对较低，但羟自由基的清除率较高；而金针菇、赤芝和香菇不仅多糖含量较高，而且对羟自由基的清除能力也较好。相比较而言，金针菇多糖具有更广阔的开发利用前景。

食用菌；菌丝体；多糖；抗氧化；羟自由基

香菇、凤尾菇、金针菇、秀珍菇、茶树菇、赤芝这6种食用菌作为我国食（药）用菌的主栽品种，不仅味道鲜美、营养丰富，还含有多种生物活性物质，如维生素、多肽、菌多糖等。多糖是一类具有高活性的生命大分子物质，它在抗肿瘤、抗凝血、刺激免疫以及降血糖、清除自由基和抗氧化方面具有一定的作用[1]。研究结果表明，食用菌多糖具有清除自由基、提高抗氧化酶活性和抑制脂质过氧化的作用，从而起到保护生物膜和延缓衰老的作用[2]。

20世纪90年代至今，国内外对香菇、凤尾菇、金针菇、秀珍菇、茶树菇、赤芝的子实体多糖的研究较多，但几乎没有对于菌丝体多糖的研究报道。从菌丝体中提取的多糖具有安全、低毒、来源广泛等特点，可代替传统抗氧化剂，具有广阔的发展前景。本实验通过对6种食用菌菌丝体多糖含量的测定及其对羟自由基的清除能力的测定，比较他们多糖含量和羟自由基清除能力的大小，以找出多糖含量较高且对羟自由基清除能力较好的菌种，旨在为相关生产企业选择多糖原材料及其开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

香菇、凤尾菇、金针菇、秀珍菇、茶树菇、赤芝菌株均为福建农林大学微生物工程实验室保藏菌种。

1.2 试剂与仪器

葡萄糖、无水乙醇、苯酚、浓硫酸、牛血清蛋白、双氧水、水杨酸、七水合硫酸亚铁。以上试剂均为进口或国产分析纯。

电子天平（BSA124S）：北京赛多利斯；（恒温）摇床（SKY-200B）：上海苏坤；恒温培养箱（DNP-9162）：上海精宏；立式高压灭菌锅（LX-B75L）：合肥华泰医疗设备有限公司；VIS-7220可见分光光度计：北京瑞利；等。

1.3 实验培养基

马铃薯（PDA）培养基配方：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂 20 g（液体培养基不需），水 1000 mL，pH 自然，121℃，湿热灭菌30 min备用。

1.4 菌丝体培养方法

1）将菌种接于PDA斜面培养基上，20℃恒温培养箱培养7 d左右，进行扩大培养。

2）将配好的培养基以100 mL/瓶分装于250 mL三角瓶中，121℃湿热灭菌30 min，用于接种。

3）采用无菌操作，从斜面上取大小相近的约0.5cm2的母种块，接种于PDA液体培养基（菌块要薄，尽量使菌块漂浮在液面上），每瓶接种3块～5块。20℃～25℃静置24 h，然后置于20℃～25℃、130 r/min左右的摇床中培养，培养时间因菌类不同而异，一般是10 d左右。

1.5 菌丝体多糖的提取方法[3-4]

热水浸提和乙醇醇析法。

1.6 菌丝体多糖含量的测定[3-8]

1.6.1 葡萄糖标准曲线的制备

1）葡萄糖标准液的制备：精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖标准品1 g，溶解稀释后定容有于100 mL容量瓶中，配成10 mg/mL的标准贮备液，精密吸取贮备液1 mL定容至100 mL，配成0.1 mg/mL的葡萄糖标准液。

2）葡萄糖标准曲线的制定：精密移取葡萄糖标准液 0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL 于 25 mL 具塞刻度试管中，加蒸馏水至2.0 mL，再各加6%苯酚溶液1.5mL并摇匀，迅速加入浓硫酸5mL，振摇，放置10min，置沸水浴中加热20 min，取出冷却至室温，于490 nm，以试剂空白为参比测定吸光值。

1.6.2 样品溶液的制备

精密称取菌丝体粗多糖粉末20 mg，加蒸馏水溶解并定容至250 mL，摇匀，即为待测样液。

1.6.3 精密度试验

取菌丝体多糖样品液各2.0 mL，加6%苯酚溶液1.5mL并摇匀，迅速加入浓硫酸5mL，振摇，放置10min，置沸水浴中加热20 min，取出冷却至室温，于490 nm，以试剂空白为参比测定吸光度,平行测定5次。

1.6.4 稳定性试验

取菌丝体多糖样品液各2.0 mL，加6%苯酚溶液1.5mL并摇匀，迅速加入浓硫酸5mL，振摇，放置10min，置沸水浴中加热20 min，取出冷却至室温，于490 nm，测定其吸光值在时间 20、30、40、50、60 min 后的变化。

1.6.5 加样回收率试验

采用加样回收法测定回收率。取菌丝体多糖样品液各1.0 mL，分别加入标准葡萄糖溶液0.1 mL，后用蒸馏水补充至2.0 mL，另以1 mL样品溶液加1 mL蒸馏水为样品含量测定，然后分别加6%苯酚溶液1.5 mL并摇匀，迅速加入浓硫酸5 mL，振摇，放置10 min，置沸水浴中加热20 min，取出冷却至室温，于490 nm，以试剂空白为参比测定吸光度,根据葡萄糖的检出量，计算其回收率：

回收率/%=（实验测值-样品所含被测成分量）/加入纯品量×100

1.6.6 换算因子的确定

精密吸取该样品液1.0 mL，蒸馏水补充至2.0 mL，再各加6%苯酚溶液1.5 mL并摇匀，迅速加入浓硫酸5 mL，振摇，放置10 min，置沸水浴中加热20 min，取出冷却至室温，于490 nm，以试剂空白为参比测定吸光度。并根据标准曲线的回归方程计算出供试液中的葡萄糖含量，按下式计算换算因子：

换算因子f=m/（C×D×V）

式中：m为称取的多糖质量,mg；C为多糖溶液中葡萄糖的质量浓度，（mg/mL）；D为多糖的稀释倍数；V为体积，mL。

1.6.7 多糖含量的测定

精密称取适量干燥后香菇、凤尾菇、秀珍菇、赤芝的菌丝体样品1 g以及金针菇、茶树菇样品0.5 g，分别置于具塞三角瓶中，按一定料液比、浸提温度、浸提时间，在热水浴中浸提5 h，用布氏漏斗抽滤后加2倍体积无水乙醇溶液，静置24 h后，离心，沉淀用蒸馏水溶解，定容至250 mL，即为待测样液。

精密吸取样品液1.0 mL，于具塞刻度试管中，加蒸馏水至2 mL，各加6%苯酚溶液1.5 mL并摇匀，迅速加入浓硫酸5 mL，振摇，放置10 min，置沸水浴中加热20 min，取出冷却至室温，于490 nm，以试剂空白为参比测定吸光度，平行测定3次。根据标准曲线的回归方程计算出多糖溶液中葡萄糖的质量分数C，并按下式计算样品中多糖的质量分数：

多糖含量=（C×D×V×f）/W×100%

式中：W为称取子实体或菌丝体的样品质量，mg；f为换算因子；C为多糖液中葡萄糖的含量，（mg/mL）；D为多糖的稀释倍数；V为体积，mL。

1.7 多糖对羟自由基清除能力的测定[9-12]

1.7.1 样品溶液的制备

精密称取一定质量的菌丝体粗多糖粉末，加蒸馏水溶解，使其配制成一定浓度（1、2、3、4、5 mg/mL）的待测样液。

1.7.2 多糖对羟自由基清除能力的测定

精密吸取4.5 mmol/L FeSO41 mL、9 mmol/L水杨酸-乙醇1 mL，相应浓度的待测溶液1 mL，于试管中，最后加入4.4 mmol/L H2O21 mL以启动整个反应。37℃反应0.5 h后，12000 r/min离心6 min，然后以蒸馏水作参比，在510 nm下测定吸光度。考虑待测溶液本身的吸光值不同，以待测溶液1 mL，4.5 mmol/L FeSO41 mL，9 mmol/L水杨酸-乙醇1 mL和蒸馏水1 mL作为待测溶液的本底吸收值。清除率计算公式为:

清除率＝[A0－（AX－AX0）]/A0×100%

式中：A0为空白对照液的吸光度；AX为待测溶液后的吸光度；AX0为待测溶液的本底吸收值。每一吸光值平行测3次，取其平均值，结果用X±SD表示，并采用t检验法。

2 结果与分析

2.1 多糖含量测定结果

2.1.1 葡萄糖标准曲线的建立

葡萄糖标准溶液的浓度及相应吸光值见表1，葡萄糖标准曲线见图1。

表1 葡萄糖标准溶液的浓度及相应吸光值Table 1 Consistence and OD of the glucose standard solution

图1 葡萄糖标准曲线Fig.1 Standard curve of glucose

由图1可看出，葡萄糖标准曲线的相关系数R2=0.9991，表明质量浓度在0.01 mg/mL～0.07 mg/mL时，葡萄糖的质量浓度与吸光值之间呈现出良好的线性关系，很好地符合了郎伯—比尔定律。

2.1.2 精密度实验结果

精密度实验结果见表2。

表2 菌丝体多糖精密度实验Table 2 The experiment to calculate the precision of mcelia polysaccharide

由表2可知，香菇、秀珍菇、赤芝、金针菇、凤尾菇、茶树菇菌丝体多糖样品溶液5次平行测定的相对标准偏差 RSD 为 0.85%、0.77%、0.92%、0.63%、0.82%和0.74%（n＝5），均小于1%，表明实验的精密度较好。

2.1.3 稳定性试验结果

稳定性试验结果见表3。

表3 菌丝体多糖稳定性实验Table 3 The experiment to calculate the stability of mcelia polysaccharide

由表3可知，香菇、秀珍菇、赤芝、金针菇、凤尾菇、茶树菇菌丝体多糖溶液的吸光值在显色后的20 min～60 min内变化不大，说明了在此段时间范围内的稳定性良好。

2.1.4 回收率试验结果

回收率试验结果见表4。

表4 菌丝体多糖溶液回收率实验Table 4 The experiment to calculate the recovery of mcelia polysaccharide

由表4可知，5次平行测定RSD均小于1%（n＝5），又根据1.6.5中公式，求得香菇、秀珍菇、赤芝、金针菇、凤尾菇、茶树菇菌丝体多糖样品溶液回收率分别为99.4%、100.9%、101.6%、108.1%、109.6%和102.3%，六者回收率均在99%～110%之间，表明本实验的测定方法是可靠、可行的。

2.1.5 多糖含量的测定结果

按照1.6.7所述方法，平行测定3次香菇、秀珍菇、赤芝、金针菇、凤尾菇、茶树菇菌丝体多糖提取液的吸光值如表5。可知，菌丝体多糖的含量茶树菇＞金针菇＞赤芝＞香菇＞凤尾菇＞秀珍菇。

2.2 多糖对羟自由基清除能力的测定结果

多糖对羟自由基清除能力的测定结果见表6。

表5 菌丝体多糖样品溶液的吸光值Table 5 The OD of polysaccharides sample solution from the mycelium

由试验结果可知，6种食用菌菌丝体多糖对羟自由基清除能力都比较好（在多糖浓度为5 mg/mL时，最大清除率在64%～84%之间），且在一定浓度（1、2、3、4、5 mg/mL）范围内六种食用菌菌丝体多糖对羟自由基清除能力随着多糖浓度的增大而增大。

表6 多糖对羟自由基的清除能力Table 6 The Hydroxyl radical scavenging of polysaccharides in mycelium

3 结论与讨论

自由基在化学结构上是指含有未配对电子的基团、分子或原子，包括超氧阴离子、羟自由基（·OH）、脂质过氧化物（LPO）等。它是人体内的正常代谢产物。在正常情况下,人体内的自由基处于动态平衡中，但是一旦该平衡被打破,就会对机体造成损害，从而引发一系列相关疾病[13]。研究发现，许多天然食品（柴胡[14]、马齿苋[15]、山药[16]等）中的多糖都具有清除自由基、抗氧化的能力，而食用菌多糖由于其毒副作用小、安全性强，与动物和植物多糖相比具有产量和质量不受自然条件影响的特点，被越来越多的人所关注。

本试验通过热水浸提以及芬顿（Fenton）反应法从6种食用菌的菌丝体中提取多糖并测定其抗氧化活性。结果表明，虽然茶树菇多糖含量最高（11.18%），但其清除羟自由基的能力最弱（在多糖浓度为5 mg/mL时，最大清除率在65%）；凤尾菇和秀珍菇虽清除率较高（在多糖浓度为5 mg/mL时，最大清除率分别为80%和71%），但他们多糖含量较低（分别为3.45%和3.14%）；而金针菇、赤芝和香菇不仅多糖含量较高（依次为7.72%、5.22%和4.84%），而且对羟自由基的清除能力（在多糖浓度为5 mg/mL时，最大清除率依次为82%、84%和75%）也较好，其中以金针菇的多糖含量和清除能力的比例最好，这为下一步对金针菇的综合开发利用提供参考依据。

[1]党蕾,郝佳欣,江海涛.几种食用菌多糖抗氧化活性比较[J].安徽农学通报,2010,16(5):76-77

[2]方积年,丁侃.天然药物一多糖的主要生物活性及分离纯化方法[J].中国药学杂志,2007,26(9):338-345

[3]王建壮,安洁吕,华冲.植物多糖含量测定的方法研究[J].海峡药学,2008,20(5):48-50

[4]于村,丁钢强,俞莎,等.香菇多糖测定方法学研究[J].中国公共卫生杂志,2000,16(3):245

[5]钟岩,潘浦群,王艳红,等.苯酚-硫酸法测定鲜人参中多糖含量[J].时珍国医国药,2008,19(8):1957-1958

[6]王文平,郭祀远,李琳,等.苯酚-硫酸法测定野木瓜中多糖含量的研究[J].食品科学,2007,28(4):276-278

[7]郑必胜,唐芳勇,闫文娟,等.苯酚-硫酸法测定广东虫草菌丝体多糖含量的研究[J].农产品加工学刊,2008(8):17-21

[8]李研,魏建和,许旭东,等.苯酚-硫酸法测定桔梗多糖含量的研究[J].时珍国医国药,2009,20(1):5-7

[9]傅博强,谢明勇,聂少平,等.茶叶中多糖含量的测定[J].食品科学,2001,22(11):69-72

[10]张俊会,王谦.杏鲍菇多糖的抗氧化活性研究[J].中国食用菌,2003,3(2):38-39

[11]游育红,林志彬.灵芝多糖肽的抗氧化作用[J].药学学报,2003,38(2):85-88

[12]颜军,徐光域,郭晓强,等.银耳粗多糖的纯化及抗氧化活性研究[J].食品科学,2005,26(9):169-172

[13]Marx J L.Oxygen free radicals linked to many diseases[J].Science,1987,235(4788):529

[14]李棣华,刘俊红,伍孝先.紫外可见分光光度法测定不同产地柴胡中多糖含量[J].天津中医药,2010,21(4):342-343

[15]张远荣,蒋企洲.马齿苋多糖清除羟自由基作用的研究[J].首都医药,2009(9):48-49

[16]孙仕玲.山药多糖含量的测定方法研究[J].农业与技术,2010,30(3):35-39

The Comparison of the Polysaccharides Obtained from Six Different Edible Fungus Mycelia

XIONG Fang,SUN Shu-jing,XIAO Ying,HU Kai-hui*
（College of Life Sciences,Fujian Agricultural and Forest University,Fuzhou 350002,Fujian,China）

The polysaccharides from Lentinus edodes,Plurotus sajorcaju,Flammulina velutiper,Pleurotus geesteranus,Agrocybe chaxingu and Ganoderma lucidum mycelium were extracted by boiling water method,and the content of polysaccharides was measured by Phenol-Sulfuric Acid Method.The results showed that the contents of polysaccharides in the six mushroom mycelium were 4.84%,3.45%,7.72%,3.14%,11.18%and 5.22%.At the same time,the antioxidant activity of the six polysaccharides was determined through the determination of hydroxyl radical scavenging capacity.The results showed that although Agrocybe chaxingu contained the highest of polysaccharide,the weakest of hydroxyl radical scavenging capacity;Flammulina velutiper,Ganoderma lucidum and Lentinus edodes,not only had more polysaccharide,and the ability of clearing hydroxyl radical was better,among them.In comparison,the polysaccharide from Flammulina velutiper has a wider development foreground.

edible fungus;mycelium;polysaccharide;antioxidant;hydroxyl radical

福建省教育厅科技项目（JA09097）

熊芳（1983—），女（汉），助理实验师，硕士，食用菌活性物质开发与利用。*

2011-12-07