增强CpG免疫刺激作用途径的研究进展

徐娜，张雪梅，王钦富

CpG 基序（CpG motifs）是指含有非甲基化的胞嘧啶（C）和鸟嘌呤（G）核苷酸核心的寡聚脱氧核苷酸（ODN）序列，又称为免疫刺激序列，一般为6个寡聚核苷酸。1995年，Krieg等[1]研究发现非甲基化的CpG 二寡聚核苷酸是病原体 DNA 免疫刺激活性的结构基础，自此，对 CpG 基序的各种研究得以展开，包括 CpG 基序免疫刺激机制、CpG 基序个数及结构对免疫刺激活性影响、CpG 寡聚脱氧核苷酸作为佐剂使用等。含有非甲基化 CpG 二核苷酸的寡聚脱氧核苷酸作为一种免疫增强剂，在体内和体外均表现免疫刺激作用，可以引起先天性免疫反应。CpG 在体内能引起明显且多样化的免疫作用，包括树突状细胞和NK 细胞增殖、巨噬细胞和B 细胞的促炎症细胞因子表达、Th1/Th2免疫应答的调控、血循环系统中的补体作用[2]。CpG 寡聚脱氧核苷酸序列作为佐剂时可明显延长机体免疫记忆的时间，在较低浓度抗原刺激时 B 细胞就能反应，产生更高纯度的抗体[3-4]。

作为疫苗佐剂，CpG 寡聚脱氧核苷酸在机体内的传递速率和降解速度是影响其效力的关键问题。而体型较大的动物需要较高的CpG 寡聚脱氧核苷酸注射量才能引起有效反应，一般要求 10 mg 以上，致使 CpG 在动物疫苗实际应用中成本较高。因此，研究增强 CpG 佐剂作用，减少CpG 应用剂量，会增加 CpG 寡聚脱氧核苷酸的应用与普及，在疾病防治中具有重要的实际意义。本文就近年有关提高 CpG 免疫刺激作用的新途径进行综述。

1 与传统佐剂苦杏仁酶、铝佐剂组合

诱导 Th1 型免疫反应的CpG 与诱导 Th2 型免疫反应的其他种类佐剂（如皂苷 A 或苦杏仁酶）的组合能导致Th1/Th2 免疫反应的相对平衡，这种作用在诸如鼠、兔、猪、牛等动物试验中得到证明。CpG 与苦杏仁酶联合制剂能明显增加血清中和抗体。事实上，即使很少量的CpG（250 μg）与苦杏仁酶混合引起的作用也比单独使用较大量 CpG（25 mg）强很多[5]。在绵羊体内 CpG是 2′5′A 合成酶的诱导剂。新生羊肺注入 CpG 与苦杏仁酶制剂，可引起 2′5′A合成酶分泌量达到最高，IFN-α、IFN-γ 分泌也有所增加，而且 CpG 用量减少 80%[6]，在猪体内的试验表明 10% 苦杏仁酶和CpG 混合物引起的免疫反应与30% 苦杏仁酶和CpG 混合物引起的免疫反应效果相同[7]，在小鼠、羊的动物实验中，两种物质混合后IgG1/IgG2a 降低，IFN-γ分泌增加，小鼠脾脏 IL-4 分泌减少[6]，显示出两者联合时对Th1/Th2 免疫反应平衡的影响，展现两者联合使用在疫苗中的潜力。苦杏仁酶增强 CpG 免疫刺激作用的具体机制还不明确，可能是因为苦杏仁酶引起注射位点组织损伤、发炎、细胞死亡、免疫细胞被募集，进而被 CpG 激活，而且苦杏仁酶作为乳剂可以帮助 CpG 缓慢释放，增加反应持久性。

铝具有免疫增强作用，是一种Th2 型佐剂，而 CpG是一种强大的Th1型佐剂，铝和CpG 联用时，有助于平衡Th1/Th2 型免疫应答。研究认为铝佐剂增强 CpG 免疫刺激作用的原因可能是铝激活一种NOD 样受体 Nlrp3， Nlrp3可与TLR4 协同作用对抗细菌脂多糖[8]。

2 与聚磷腈组合

聚磷腈主链磷原子上的两个侧基可被具有不同特性的有机基团取代，从而得到性能不同的高分子聚合物，取代基的性质和数目会影响聚磷腈高分子的物化性质。PCPP是聚磷腈的一种，它是一类人工合成的可溶于水、可生物降解的聚合高分子物质，具有特殊结构和其他有机高分子难以比拟的特性，在生物医学领域被用于疫苗佐剂和药物载体（表1）。PCPP 与CpG 联合使用有两种途径：一是可溶性的PCPP-CpG 制剂；另一种是用单价盐溶液（NaCl）和二价阳离子（CaCl2）处理 PCPP，通过凝聚形成直径为0.5～2.5 μm 含 CpG的PCPP 球状微粒。

表1 聚磷腈的应用

PCPP 免疫时，Th2 反应占优势；可溶性的PCPP-CpG诱导特异性抗体 IgG1 表达，IgG2a 反应显著增强，抗体水平是单独使用 CpG 或者 PCPP 所无法达到的，产生的IFN-γ 明显增加[9]；当含 CpG的PCPP 球状微粒免疫小鼠时，引发强烈的Th1 反应，而且 CpG 在淋巴细胞中停留的时间更长，但是受球状微粒直径大小的影响，微粒崩解时间 10～24 h 不等。

对 PCPP 佐剂作用机理的研究较少，机制尚不明确，对于PCPP 与CpG 协同作用的机制也不清楚。PCPP 作为一种高分子物质，在室温避光条件下能保存数年，临床应用之前还需要更多的实验依据以保证使用的安全性。

3 与多种TLR组合联用

病原体相关分子模式（PAMP）包括脂类、蛋白和核酸。不同种类 TLR 可以识别不同种类 PAMP，引起的下游反应也各不相同[10]。CpG 基序作为一种PAMP 可与哺乳动物的TLR9 相互识别，进而启动依赖 MyD88的信号级联反应[11]，提高 mRNA 转录水平，引发多种细胞的成熟、分化、增殖，多种细胞因子的表达增加。

聚肌胞苷酸 poly(I:C) 作为TLR3 配体，可被 TLR3识别，激活 MyD88 依赖和非依赖途径[12]。Poly(I:C) 已在很多兽用疫苗中作为佐剂使用，它可以有效增强 Th1 型反应，在猪体内它能有效地诱导 IFN的产生，而且诱导单核细胞 MHCII和CD80/CD86的基因表达以及趋化因子、TLR-5、TLR-9、IL-12p35的产生[13]。Poly(I:C) 与CpG 联合使用时，能协同上调细胞因子的表达，包括 IL6、IL1A、IFNA6、IFNB1、IL33、IL6、IL19、IL12A、IL10、CSF3、IL1F6等。有趣的是，编码 IL33、IL19、IL12A和神经肽的基因在poly(I:C) 与CpG 两种物质分别刺激时不会发生明显变化，但是当 poly(I:C) 与CpG 两种物质联合使用时表达量会强烈增加。

R-848是人类 TLR7/8的人造配体。在HBsAg 疫苗动物试验中，R-848和CpG 均有免疫刺激作用，CpG 激活体液免疫和细胞免疫的作用要优于R-848。然而，CpG 寡聚脱氧核苷酸和R-848 联合应用并没有表现协同免疫刺激作用，原因可能是两者作为不同 TLR的配体，在激活下游反应时 CpG 寡聚脱氧核苷酸和R-848 重叠激活免疫细胞[14]。

4 佐剂共传递系统

CpG 寡核苷酸的临床应用面临很多问题，包括在机体内的稳定性、毒性，不利的药代动力学特点，缺少靶细胞特异性等。因此，有必要构建有效保护 CpG 寡聚脱氧核苷酸并有助于抗原与CpG 寡聚脱氧核苷酸共传递的复合载体系统。

基于脂质体的传递系统可用于保护 CpG 寡核苷酸，调节 CpG 寡核苷酸分配，从而提高免疫细胞定位效率，促进胞内摄取。脂质体介导的传递能增加 CpG 寡核苷酸的免疫刺激效应，提高预防和治疗效率。脂质体封装 CpG寡核苷酸为其达到最佳免疫刺激和治疗效果提供了可行的方法。含CpG 寡聚脱氧核苷酸的脂质体微粒作为佐剂与单纯 CpG寡聚脱氧核苷酸佐剂相比，CpG 被递呈细胞摄取的几率提高近一倍，体液免疫（抗原特异性血清、IgG2a、IgA、CTL分泌量）和细胞免疫（脾细胞增殖、IFN-γ 分泌量、细胞毒性等）水平增加 10～100 倍[15]。含 CpG 寡聚脱氧核苷酸的脂质体微粒经由淋巴注射、皮肤注射、皮下注射、滴鼻 4种途径免疫时，递呈细胞摄取、IgG2a 滴度都有不同程度提高[16]，反映出含 CpG 寡聚脱氧核苷酸的脂质体微粒有较广的适用范围。

可电离的阳离子脂质体是一种纳米粒子，在生理 pH时显中性。由于脂质的疏水性，本身会形成双层的膜脂质体小泡，表面电荷变化小，这是与传统脂质体的不同之处。寡聚脱氧核苷酸是聚阴离子，其包装就是依靠在酸性 pH 时两种物质间的静电作用，形成含有寡聚脱氧核苷酸的中性微粒[17]。还有一些可生物降解的阳离子微粒子共载体（如聚乳酸-羟基乙酸共聚物）可依附于带负电寡聚脱氧核苷酸与带正电微粒子表面之间的电荷作用，小鼠试验数据表明[18]此共载体与单一 CpG 相比，lgG2a 活性可增强 50 倍，毒素中和活性滴度增加近 10 倍。

另外，壳聚糖载体具有天然免疫原性，可以增强 CpG寡聚脱氧核苷酸对机体内酶的稳定性。壳聚糖-CpG 复合物进入机体后，能被巨噬细胞表面的多糖类受体识别，激活巨噬细胞 RAW264.7；同时，也能促 NK 细胞和T 细胞活化，分泌多种细胞因子，表现出与CpG 寡聚脱氧核苷酸协同增效作用。壳聚糖-CpG 复合物与单纯使用壳聚糖或 CpG 相比，前者抗体产生水平最高，持续时间长，CD4+ 细胞水平显著增加[19]，增强了 CpG的免疫活性。因此，壳聚糖包裹CpG 寡聚脱氧核苷酸载体是一类很有应用前景的共载体系统。

总之，优良的疫苗佐剂不仅能引起较强的免疫刺激作用，还要物美价廉、易于推广。通过其他物质增强 CpG 免疫刺激作用，为降低 CpG 使用量进而降低成本提供有效途径，也为CpG 作为佐剂的研究提供新的思路和研究方向。随着生化技术的日新月异、分子生物学和基因表达技术的飞速发展，CpG 作为佐剂的研究将会有新的发展和突破。

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