APP转基因小鼠脑组织中4.1B蛋白的表达研究

段 萍，李月美，韩雪飞，刘俊玲，王若愚，鄢文海，邢 莹

(1.郑州大学 基础医学院，2.郑州大学 医学院干细胞研究中心，3.郑州大学 临床医学系2008 级本科生，郑州450052;4.新乡医学院，河南 新乡453003)

4.1 蛋白发现于1976年，因红细胞膜蛋白经三维SDS—PAGE 电泳后因其所处4. 1 条带被命名(4.1R 蛋白)，此后又相继发现了3 种与红细胞中4.1R 有很高同源性的蛋白质，根据它们的组织分布将其分为4.1G(广泛表达)、4.1N(神经细胞特异表达)、和4.1B(主要在脑中表达)［1-2］。4.1 蛋白家族成员是细胞骨架的一个基本成分，在维持细胞的正常形态和生物物理特性及膜结构的完整性中发挥非常重要的作用。本实验利用阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)的动物模型，即淀粉样前体蛋白(β-amyloid precursor protein，APP)转基因小鼠，研究4.1B 蛋白在APP 转基因小鼠脑组织中的表达特性，探讨4.1 蛋白家族成员与AD 病理学特征的关系，以进一步揭示AD 的发病机制。

1 材料与方法

1.1 材料 APP 转基因小鼠(中国医学科学院实验动物研究所购买)，雌雄不限。兔抗鼠4.1B 多克隆抗体浓缩型(美国纽约血液中心馈赠);APP 695/770 一抗、二抗(中杉金桥);半干式电转膜仪(BIO RAD);PCR 扩增仪(德国Biometra 公司);数码凝胶图像处理系统(UVI 公司);免疫组织化学染色灰度值采集及分析系统(上海山富科学仪器有限公司Biosens Digital Imaging Systems V1.6);PCR 引物合成(上海生工)。

1.2 鉴定转基因小鼠APP 基因 剪取10 ～12月龄APP 转基因小鼠鼠尾1.0 ～1.5 cm 左右，经蛋白酶K 消化过夜后，等体积酚、氯仿分别抽提，乙醇沉淀，干燥后，加TE 溶解，采用PCR 技术鉴定APP 基因。引物根据其Genebank 上所查序列使用primer 5.0 软件设计，由上海生物工程公司合成:Forward:5＇-CCCTGAACCTGAAACATAAAAT - 3’，Reverse:5＇-GCTACGAAAATCCAACCTACAA-3’，产 物 大 小225 bp。扩增条件为:94 ℃预变性3 min;进入PCR循环，94℃变性30 s;退火温度56 ℃，30 s;72 ℃延伸1 min;30个循环后，72 ℃延伸5 min。DNA 凝胶电泳后，能出现扩增产物的小鼠标记为APP(+)鼠，未获得扩增产物的小鼠标记为APP(-)鼠。

1.3 免疫组织化学法 取APP(+)鼠和APP(-)鼠，经乙醚麻醉、预冷生理盐水冲洗血液、4%的多聚甲醛溶液缓慢输液、固定1 h 左右，快速分离全脑，切去脑干放入新鲜配制浓度为4%多聚甲醛溶液约24 h，石蜡包埋、切片(厚4 ～5 μm)。在每张载玻片上同时放置阴性和阳性鼠脑组织切片，经常规脱蜡、水化，3%甲醇H2O2溶液中浸泡30 min，蒸馏水洗3次，每次5 min;热修复抗原修复后，经自然冷却5 min，滴加山羊抗鼠非免疫血清，室温孵育30 min;弃切片上血清，分别加APP 多克隆抗体(1∶100)、4.1B多克隆抗体(1∶100);PBS 洗3 次，每次5 min，滴加生物素标记的山羊抗小鼠IgG 抗体，室温孵育30 min;PBS 液洗3 次，滴加辣根过氧化物酶标记多聚物试剂，室温孵育30 min;PBS 液洗3 次，DAB 显色;苏木素复染3 min，中性树胶封片。显微镜下观察，采集免疫组织化学染色结果并进行灰度分析:分别对每张染色图片随机选取五个视野进行灰度值分析，取所得灰度值最后一列的数值(平均积分光密度)为该指标的一个灰度值。

1.4 免疫印迹法 分别取APP(+)鼠和APP(-)鼠新鲜脑组织，分离小脑、海马和皮层分别称重，按0.1 g组织加裂解液总量1 ml 加裂解液于组织匀浆器内冰上研磨，13 000 g 离心裂解物30 min，收集上清液，95 ℃5 min 充分变性蛋白，BCA 法测蛋白浓度。电泳转膜后，将硝酸纤维素膜置封闭液中封闭3 h，然后加入一抗，4℃过夜;用1 ×TTBS 洗3 次，每次5 min;加入二抗，室温轻摇2 h;再用TTBS 洗3次，每次5 min;保鲜膜包裹，暗室内曝光。用凝胶图像处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。

1.5 统计学处理 采用SPSS 12.0 统计软件进行分析。独立实验重复3 次，数值用样本均数±标准差(±s)表示，采用独立样本t 检验比较两组间差异，以χ2=0.05 为检验标准。

2 结果

2.1 APP 转基因阳性和阴性小鼠的鉴别结果 经PCR 扩增和DNA 凝胶电泳后，有APP 阳性条带的转基因小鼠设为APP(+)组，无APP 阳性条带的小鼠设为APP(-)组(图1)。

图1 APP 转基因小鼠PCR 鉴定结果

2.2 免疫组织化学法结果 在APP(+)鼠和APP(-)鼠大脑皮层和海马均可见4.1B 着色阳性的神经细胞。APP(+)组小鼠大脑皮层和海马区阳性着色程度明显强于APP(-)组小鼠(P ＜0.05)(如图2，表1)。

2.3 免疫印迹法结果 APP(+)组和APP(-)组小鼠脑组织海马、皮层和小脑中均有4.1B 蛋白的表达(如图3)，对免疫印迹法结果目的条带和内参灰度值比值数据进行分析，结果表明APP(+)组海马、皮层和小脑的4.1B 蛋白表达均明显高于APP(-)组(P ＜0.05)。

图2 免疫组织化学法检测APP 转基因小鼠皮层和海马中4.1B 蛋白表达(×200，DAB 染色)

表1 免疫组织化学法检测APP 转基因小鼠皮层和海马中4.1B 蛋白表达(单位:灰度值， ±s，n=3)

表1 免疫组织化学法检测APP 转基因小鼠皮层和海马中4.1B 蛋白表达(单位:灰度值， ±s，n=3)

注:与APP(-)相比，1)P ＜0.05。

组别 皮层脑组织 海马组织APP(+)组 183.85 ±17.421) 192.30 ±13.671)APP(-)组60.87 ±6.72 56.12 ±9.53

图3 2组小鼠不同脑组织中4.1B 蛋白含量

3 讨论

阿尔茨海默病是一种神经系统退行性疾病，临床可引起记忆、感觉、判断、思维、运动和情感反应能力降低［3-4］。APP 基因表达改变是AD 病理机制之一:APP 蛋白经过酶切产生Aβ1-42等毒性片段，从而导致AD 的其他病理变化如老年斑形成和神经原纤维缠结等［5-6］。

本研究采用APP 转基因小鼠来研究4.1B 蛋白表达。APP 转基因小鼠是研究AD 的理想动物模型，该模型是通过显微注射方法向动物体内转入人的APP 基因构建，已由中国科学研究院成功建立并使用［7］。APP 转基因小鼠在6 ～8月龄以上即可形成AD 病变特征。本实验选用10 ～12月龄模型鼠并根据PCR 结果将其分为APP(+)和APP(-)小鼠。

家族蛋白是一种骨架蛋白，广泛表达上皮细胞内，参与细胞膜蛋白和细胞骨架蛋白的连接，并介导蛋白-蛋白之间、蛋白-细胞膜之间的相互作用，以维持细胞的形状、结构和功能。在本研究中，笔者发现APP 转基因小鼠脑组织各区域，包括大脑皮层、海马、小脑，均有4.1B 蛋白表达，与4.1B 蛋白表达已有的报道一致。

对AD 患者尸检结果中显示脑内4.1 蛋白异常聚集［8］，但其产生的机制以及与AD 病理机制的关系尚不清楚。在本研究中，笔者发现在脑组织各区域中，APP(+)小鼠的4.1B 蛋白表达显著高于APP(-)小鼠，推测APP 高表达可能通过上调转录和翻译来促进4.1B 蛋白表达，或通过下调4.1 蛋白降解途径来增加4.1 蛋白表达。已有文献证明4.1 蛋白可与APP 的羧基端序列(Y687KFFEQMQN)相结合［8］，因此APP 高表达有可能结合4.1 蛋白并阻止其降解。因此，笔者认为AD 病患者APP 蛋白代谢异常可能影响4.1 蛋白的代谢，导致4.1 蛋白在脑内堆积，共同参与AD 的发病过程。

［1］Holzwarth，G.，J. Yu，and T. L. Steck. Heterogeneity in the conformation of different protein fractions from the human erythrocyte membrane［J］. Supramol Struct，1976，4(2):161 -8.

［2］Peters，L.L.，H.U. Weier，L.D. Walensky，et al. Four paralogous protein 4.1 genes map to distinct chromosomes in mouse and human［J］. Genomics，1998，54(2):348 -50.

［3］Fita，I. G.，A. M. Enciu，and B. P. Stanoiu. New insights on Alzheimer＇s disease diagnostic［J］. Rom J Morphol Embryol，2011，52(3):975 -979.

［4］Green，K.N.，I.F. Smith，and F.M. Laferla. Role of calcium in the pathogenesis of Alzheimer’s disease and transgenic models［J］. Subcell Biochem，2007，45:507 -521.

［5］Klunk，W.E. Amyloid imaging as a biomarker for cerebral betaamyloidosis and risk prediction for Alzheimer dementia［J］. Neurobiol Aging，2011，32(1):S20 -36.

［6］Zhang，H.，Q. Ma，Y.W. Zhang，and H. Xu. Proteolytic processing of Alzheimer＇s beta-amyloid precursor protein［J］. Neurochem，2012，120(1):9 -21.

［7］常 洋，秦 川，尹红星，等. 建立阿尔茨海默症的转基因动物模型［J］. 解剖学报，2000，31(2):144 -147.

［8］Sihag，R.K.，L.W. Wang，A.M. Cataldo，et al. Evidence for the association of protein 4.1 immunoreactive forms with neurofibrillary tangles in Alzheimer＇s disease brains. Brain Res，1994.656(1):14 -26.