黄芩苷镧(Ⅲ)、钇(Ⅲ)配合物的合成及生物活性研究

张齐雄，施伦勇，刘衍季

西南大学药学院，重庆400715

黄芩苷镧(Ⅲ)、钇(Ⅲ)配合物的合成及生物活性研究

张齐雄*，施伦勇，刘衍季

西南大学药学院，重庆400715

改进以往反应条件，合成了黄芩苷镧(Ⅲ)、黄芩苷钇(Ⅲ)配合物，利用IR、UV、LC-MS和金属元素含量测定对配合物进行了表征。采用MTT法分别考察了两种新化合物的抑菌活性(金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌、白色念珠菌)和抗肿瘤活性(A549、HepG2)，采用灌胃法考察化合物对小鼠的急性毒性。结果表明:黄芩苷在与金属配合后，结构表征发生了一定的变化，配合物无金属离子毒性反应，并且其抑菌、抗肿瘤作用均显示出黄芩苷镧＞黄芩苷钇＞黄芩苷。

稀土金属;黄芩苷;配合物;抗菌;抗肿瘤

稀土金属在抗菌、抗病毒、抗肿瘤等多种生物活性方面与黄酮类化合物有相似之处［1-6］;但稀土无机盐的毒性作用［7，8］限制了其应用前景，故将黄酮类与稀土金属离子配合不仅可以降低金属离子毒性［9］，也能增强其活性。黄芩苷可与过渡金属如锌、铝、铬、铜等生成稳定的配合物［10-13］，但其反应均选择在有机溶剂、强碱条件下进行，产率低。改进实验反应条件，得到高产率的黄芩苷镧和黄芩苷钇两种配合物，并对其抗菌抗肿瘤活性进行研究。

1 黄芩苷稀土金属配合物合成及表征

1.1 仪器及试剂

黄芩苷(西安小草植物科技有限责任公司，纯度大于95%，批号XC090722)，LaCl3·7H2O(分析纯)、Y(NO3)3·6H2O(分析纯)、EDTA(分析纯)、碳酸氢钠(分析纯)，85-1恒温磁力搅拌器(常州国华电器有限公司)，红外光谱仪(PerkinElmer FT-IR Spectrometer Spectrum One，PerkinElmer公司)，U-1800紫外扫描仪(Hitach公司)，质谱(Bruker HCT ESI-MS(300 MHz)Spectrometer、ABI公司)。

1.2 黄芩苷稀土金属配合物的合成

准确称取黄芩苷3 g，加入到100 mL水中，边搅拌边按摩尔比1∶1逐滴加入0.565 g NaHCO3溶液，待黄芩苷完全溶解后，再分别加入不同摩尔比(3∶1、2∶1、1∶1)的LaCl3·7H2O，Y(NO3)3·6H2O溶液，30℃下搅拌反应约2 h，分别得到带有金属光泽的棕黑色和棕红色沉淀，经过蒸馏水数遍洗涤，50℃下烘干至恒重。

1.3 结构表征

1.3.1 产物金属元素含量分析

由表1中金属含量接近理论值可知，黄芩苷与两种金属以不同摩尔比反应时，所得产物均为三分子黄芩苷络合一分子金属的结构。

表1 黄芩苷-镧、钇配合物的金属含量Table 1 Metal content of baicalin complexes with La(III)、Y(III)

1.3.2 紫外图谱分析

黄芩苷在275 nm及316 nm有两个最大吸收峰，而配合物在275 nm的吸收峰微红移至277 nm，316 nm波长处吸收峰消失，表明发生配位后，黄芩苷结构发生了改变，又因金属具有一定的吸电子作用，使电子跃迁所需的激发能减小及整个分子的电子离域程度增大，故而发生红移。

1.3.3 红外图谱分析

黄芩苷及其稀土配合物主要基团的红外数据见表2。

表2 黄芩苷及其稀土配合物主要基团的红外数据(cm-1)Table 2 Position of the most important bands in IR spectra of baicalin and its complexes

推测氧的孤对电子与金属离子的空轨道形成配位键后导致C=O的电子云密度降低，故使得配合物4位C=O的伸缩振动吸收峰较黄芩苷红移53 cm-1。配合物较黄芩苷5位O-H的伸缩振动吸收峰分别红移了约42 cm-1和35 cm-1，说明黄芩苷的酚羟基氧也与金属离子发生了作用。另由于金属离子对C-O中氧的电子离域作用使得C-O的伸缩振动吸收峰红移了约9 cm-1和13 cm-1。综上，黄芩苷的4位C=O和5位OH与金属离子发生了配位。

1.3.4 质谱分析

黄芩苷-镧的分子离子峰为1473.8，碎片峰1297.2为分子离子断裂失去一分子葡萄糖苷(176 Da)所得，碎片峰445.7为分子离子断裂后所得黄芩苷(445 Da)的峰，因此，推定黄芩苷-镧配合物由黄芩苷×3+La组成。另根据红外结果知其在4位C=O和5位OH配位，因此，推定黄芩苷-镧的结构如图1所示。

黄芩苷-钇的分子离子峰为1422.9，碎片峰1247.9为分子离子断裂失去一分子葡萄糖苷(176 Da)所得，碎片峰893.6为分子离子断裂失去三分子葡萄糖苷(176 Da×3)所得，因此，推定黄芩苷-钇配合物由黄芩苷×3+Y组成。另根据红外结果知其在4位C=O和5位OH配位，因此，推定黄芩苷-钇的结构如图1所示。

图1 黄芩苷-M的结构(M=La或Y)Fig.1 Baicalin-M complex(M=La or Y)

2 黄芩苷-稀土金属配合物生物活性

2.1 仪器、试剂及实验动物

Thermo 6500二氧化碳培养箱，BioTek ELX800酶标仪，超净工作台(苏州净化设备厂)，96孔培养板(Costar公司)，胎牛血清(Gibco公司)，噻唑蓝(MTT)，二甲基亚砜(DMSO)，胰蛋白酶(Amresco公司)，健康昆明小鼠(体重20±2 g，购于重庆医科大学实验动物中心，许可证号SCXK(渝)2007-0001)。

2.2 急性毒性实验

将黄芩苷及黄芩苷稀土金属配合物溶于1% NaOH溶液中(最终pH为7.1)，配成10%黄芩苷或黄芩苷稀土金属溶液，根据最大耐受剂量法［14］，每只小鼠灌胃给予5 g·kg-1，观察两周，所有小鼠活动均稍微减弱，短时间内得到恢复，两周后所有小鼠均未出现死亡，生长良好。

2.3 抗菌实验

黄芩苷及其配合物使用1%NaOH溶解，溶液最终pH值为7.1。使用划线法将金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、白色念珠菌取得单个菌落并在培养基中培养后，配置菌液浓度为2× 105个∕mL，采用96孔板法倍比稀释5个浓度(浓度∕mg·mL-1∶2、1、0.5、0.25、0.125)的化合物，每个浓度设5个复孔，再在每个孔中加入等量的菌液，细菌在培养箱中37℃培养24 h、真菌30℃培养48 h后，观察各孔是否透明，对应化合物溶液浓度最小的透明的孔即为最小抑菌浓度MIC，结果见表3。

表3 黄芩苷及其稀土配合物的MICTable 3 The antibacterial activity of baicalin and its complexes (MIC)

2.4 抗肿瘤实验

取对数生长期的肿瘤细胞(A549、HepG2)用含10%胚牛血清的RPMI-1640培养基配成1×104个∕mL。接种于96孔板内，每孔100 μL，置37℃、5%CO2培养箱中培养24 h。吸出并更换培养基后，待细胞长至80%～90%融合时，加入不同剂量的黄芩苷及黄芩苷稀土金属配合物溶液，使其终浓度(μM)分别20、40、80、160、320，每个浓度5个孔，每一浓度均设置溶剂对照。加药培养24 h后，每孔加入MTT培养4 h，弃上清液后加入DMSO，振荡并在酶标仪中于490 nm处测定吸光度(A)值。以溶剂对照组处理的肿瘤细胞为对照组，取5个复孔的平均值，根据公式:抑制率=(1-实验组A值/对照组A值)×l00%计算化合物对细胞的抑制率，计算出IC50，结果见表4。

表4 黄芩苷及其配合物的抗肿瘤活性(IC50)Table 4 The antineoplastic activity of baicalin and its rare earth metal compounds(IC50)

3 讨论

3.1 合成

本实验根据黄芩苷的结构特点，选用等摩尔的NaHCO3溶解黄芩苷，一方面是其与黄芩苷糖元上的羧基成盐后，水溶性大大增加，较以往文献以吡啶做溶剂更为安全，产率提升了30%～70%左右。二是避免碱性太强造成与稀土元素形成沉淀，不利于配合物形成。故对于黄芩苷与其他稀土金属配合物的合成具有参考意义。

本实验合成得到未见报道的黄芩苷-镧，并根据对产物一系列表征结果确定了配合物的分子结构。而已有报道的黄芩苷-钇用常规方法络合比为1∶1［15］，且该报道未能合成得到除铈、钇以外的其他黄芩苷稀土金属配合物。本实验三种比例所得产物均为未见报道的络合比为3∶1的新化合物，关于方法不同造成所得产物结构不同的原因尚需进一步研究。

本实验在反应温度和反应时间一定的条件下，考察了黄芩苷和稀土金属反应摩尔比对反应产率的影响，结果见表5

表5 黄芩苷稀土金属配合物合成反应的产率Table 5 The yield of synthesis reaction of baicalin with rare earth metal

由表5可知当黄芩苷与稀土金属的摩尔比为3∶1，符合反应方程式比例时，反应产率最低，说明该反应的平衡常数(K)值较小;而摩尔比为2∶1，即金属较过量时，会有利于黄芩苷与其发生配合，原因可能是较高浓度的金属离子使得K值增大，化学反应平衡正向移动，产率增高;当摩尔比为1∶1时，反应产率反而降低，可能是由于反应体系黄芩苷浓度过低而不利于反应进行。其具体原因尚需研究。

3.2 生物活性

急性毒性试验表明黄芩苷-镧、黄芩苷-钇对小鼠灌胃LD50＞5 g·kg-1。根据急性毒性(LD50)剂量分级，故可初步表明黄芩苷-镧、钇配合物经口给药属实际无毒范围［14］。其毒性较低的原因可能是稀土金属络合后，其体内代谢方式发生改变，加快了稀土金属的代谢排出，体内积累减少，使得配合物无金属离子的毒性反应。

由表3可知，除黄芩苷-钇对沙门氏菌的抗菌活性相比提升较小外，黄芩苷-镧和黄芩苷-钇对上述5种菌(含革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌)的抗菌活性均较黄芩苷提升一倍以上，表明二者为广谱抗菌化合物，特别是黄芩苷-镧对白色念珠菌具有良好的抑菌效果。从表4中可得到黄芩苷-镧和黄芩苷-钇对A549和HepG2生长的抑制效果明显强于黄芩苷，且均为黄芩苷-镧＞黄芩苷-钇。

合成得到的配合物的抗肿瘤作用强于黄芩苷，普遍认为原因是金属配合物可通过插入到DNA的碱基对之间，通过破坏碱基堆积力，从而影响DNA分子的内部构型，从而抑制DNA分子的进一步遗传和复制;另外配合物存在金属，能使蛋白质立体构象发生变化以致蛋白质变性，使得配合物对微生物的生长抑制作用增强;也可能是发挥了配体与金属的协同作用。具体机制有待深入研究。

另外黄芩苷-镧与黄芩苷-钇的其他生物活性如抗病毒、抗氧化、防治骨质疏松症等方面尚需进一步研究。由此可见对稀土金属黄芩苷配合物的研究对稀土金属的医药开发和传统中药的新应用有着重要的意义。

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Research on Synthesis and Biological Activities of Baicalin-La(Ⅲ)、Y(Ⅲ)Complexes

ZHANG Qi-xiong*，SHI Lun-yong，LIU Yan-ji
College of Pharmaceutical Sciences，Southwest University，Chongqing 400715，China

Baicalin-La(Ⅲ)、Y(Ⅲ)complexes was synthesized by a new method and characterized by IR、UV、LC-MS and metal elemental analysis.Their antimicrobial activity(Staphylococcus aureus，hay-bacillus，Escherichia coli，salmonella and Candida albicans)and antitumor activity(A549 and HepG2 cells)were tested and compared with baicalin through MTT.The result indicated that the structure of baicalin-La，baicalin-Y complex has changed greatly comparing with baicalin.The acute toxicity testing of mice showed that the compounds had no metal ion toxicity.The bioactivities about antimicrobial efficacy，antitumor efficacy were best for baicalin-La，secondary for baicalin-Y and worst for baicalin.

baicalin;rare-earth metal;complexes;antibacterial;antitumor

1001-6880(2012)10-1398-04

2012-03-14 接受日期:2012-06-21

国家级大学生创新创业训练计划(201210635074)

*通讯作者 E-mail:zhangqixiong@vip.qq.com

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