超声辅助提取凤丹籽总黄酮的工艺研究

吴 悠，李梅青*，孙 强，陈 健，吴计划，王 芬

1安徽农业大学茶与食品科技学院，安徽合肥230036;2北京同仁堂安徽中药材有限公司，安徽铜陵244000

超声辅助提取凤丹籽总黄酮的工艺研究

吴 悠1，李梅青1*，孙 强1，陈 健1，吴计划2，王 芬2

1安徽农业大学茶与食品科技学院，安徽合肥230036;2北京同仁堂安徽中药材有限公司，安徽铜陵244000

本文以经脱脂处理后的凤丹籽为原料，在单因素实验的基础上，选取乙醇浓度、料液比、超声时间和超声功率为自变量，以总黄酮得率为响应值，采用Box-Behnken响应面设计分析方法优化凤丹籽总黄酮的提取工艺。通过此模型得出:超声时间对凤丹籽总黄酮提取的影响最为显著，超声时间和乙醇浓度，超声时间和料液比，超声时间和超声功率之间的交互作用显著。模型预计凤丹籽总黄酮提取的最佳工艺条件为:乙醇浓度75%，料液比1:21 g/mL，超声时间49 min，超声功率240 w，在此条件下，总黄酮得率平均值为9.015 mg/g。

凤丹籽;总黄酮;紫外分光光度法;超声提取;Box-Behnken响应面设计

凤丹(Paeonia ostii T.Hong et J.X.Zhang)，即铜陵牡丹，属江南牡丹品种群，主要产于铜陵顺安镇、钟鸣镇和芜湖市南陵县何湾镇。由于上述地区独特的土壤和气候条件，所产的凤丹皮被实践证明为药效最好的丹皮品种［1］，并于2006年列为“国家地理标志保护产品”［2］。凤丹籽是凤丹开花后结出的种子，铜陵地区年产量约为1500 t。但至今未对凤丹籽资源进行开发和利用。目前，国内外对牡丹籽的研究主要集中于油脂成分提取和活性成分分析，文献报道了牡丹籽中含有芍药苷、木犀草素、芹菜素［3-5］等活性物质，尚未报道黄酮等活性成分的提取工艺及其相关研究。

前期研究表明，凤丹籽中含有一定量的黄酮类物质。黄酮类化合物具有多种生物活性，如免疫激活、抗氧化、降血脂、降胆固醇及雌激素样作用，正以其保健和药用价值受到人们的高度关注［6-9］。为充分开发和利用凤丹籽中生物活性成分，本研究采用超声辅助溶剂法提取凤丹籽中总黄酮，通过单因素试验和Box-Behnken响应面优化提取工艺，并采用紫外分光光度法测定凤丹籽总黄酮的含量，以期为合理开发利用凤丹籽资源提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料

凤丹籽(北京同仁堂安徽中药材有限公司提供)经洗净、粉碎、过筛后，采用乙醚浸提12 h，置于50℃的烘箱中烘干，过40目筛备用。

芦丁标准品(中国药品生物制品检定所，批号: 20110530，纯度:99.9%);

无水乙醇、亚硝酸钠、氯化铝、氢氧化钠、硝酸铝等，以上均为分析纯。

1.1.2 仪器

UV-1800型紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司;

RE52AA型旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂;

KQ-250DE型数控超声波清洗器 昆山超声仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液的配制和标准曲线的绘制

采用亚硝酸钠-硝酸铝分光光度法［10］。分别配制浓度为100、200、400、600、800、1000 mg/L芦丁标准液。加2.25 mL蒸馏水于试管中，取0.5 mL芦丁标准液加入试管，加入0.15 mL 5%NaNO2，静置6 min，加入0.3 mL 10%的AlCl3·6H2O，静置5 min，加入1.0 mL 1 mol·L-1NaOH，振荡均匀后在波长为510 nm下进行比色测定，绘制标准曲线。

所得数据经回归处理，得到芦丁含量C(mg/ L)与吸光度A的回归方程为A=0.0102C+ 0.0029，R2=0.9993。结果表明:芦丁浓度与吸光度在25 mg/L～1000 mg/L范围内具良好的线性关系。

1.2.2 样品溶液配制和总黄酮含量的测定方法

准确称取一定质量脱脂凤丹籽粉末于100 mL三角瓶中，分别加入一定量的提取溶剂，在一定超声条件下提取2次，合并提取液，过滤2次，并在30℃的条件下旋转蒸发，待溶液蒸干后，加30%乙醇溶液将其完全溶解，并定容于100 mL容量瓶中，作为待测液。准确量取0.5 mL待测液，操作同1.2.1项，测定其在510 nm处测定吸光度，代入回归方程，计算总黄酮含量。

1.2.3 单因素试验

采用超声辅助提取，考察乙醇浓度、液料比、超声功率、超声时间对总黄酮得率的影响。通过固定上述任意三个影响因素的值，变化单一影响因素考证其对凤丹籽总黄酮得率的影响。固定值分别为乙醇浓度70%、料液比1∶15 g/mL、超声时间30 min、超声功率225 w。

1.2.4 Box-Behnken响应面试验设计

以凤丹籽总黄酮得率(mg/g)为响应值，根据单因素试验的结果设计出响应面分析实验的因素水平编码表，见表1。并采用Excel、Origin 7.5和Design Expert 7.0对试验结果进行数据处理。

表1 因素水平编码表Table 1 Experimental design of 4 factors and 3 levels in response surface method

表2 黄酮提取响应面分析设计方案及结果Table 2 Design scheme and results of response surface analysis on extraction of total flavones

21 0 0 0 0 8.813 22 0 0 -1 1 7.502 23 1 0 0 -1 8.045 24 0 1 1 0 7.915 25 -1 0 -1 0 7.893 26 0 -1 0 1 7.134 27 -1 1 0 0 7.626 28 1 1 0 0 7.021 29 0 0 0 0 8.700

2 结果与分析

2.1 单因素试验

按1.2.3方法，考察乙醇浓度在50%～100%范围内每间隔10%的变化、料液比在1∶10 g/mL～1∶30 g/mL范围内每间隔5 g/mL变化、超声时间在10 min-60 min范围内每间隔10 min变化、超声功率在125 w～250 w范围内每间隔25 w变化对总黄酮得率的影响。结果显示，乙醇浓度为80%、液料比为1∶20 g/mL、提取时间为40 min、超声波功率为225 w时，总黄酮得率最高。

2.2 Box-Behnken响应面试验结果与分析

2.2.1 Box-Behnken响应面试验设计及结果

根据单因素实验结果，在1.2.4试验设计中乙醇浓度、液料比、超声时间、超声功率的零水平分别为80%、1∶20 g/mL、40 min、225 w。Box-Behnken响应面试验设计及总黄酮测定结果见表2。

2.2.2 响应面结果分析

通过软件Design-Expert7.0对表2中的实验数据进行二次多项式回归拟合，建立二元多次回归方程，Y=8.78+0.17X1+0.2X2+0.27X3+0.1X4+0.09X1X2+0.21X1X3-0.12X1X4+0.19X2X3+0.09X2X4+ 0.32X3X4-0.28-1.24-0.35-0.23，对该方程的回归分析和方差分析如表3所示。

表3 回归与方差分析结果Table 3 Regression analysis results of extraction parameter of total flavones

由表3可以看出，方程的因变量与自变量之间 线性关系明显，该模型和失拟项均显著，并且该模型R2=0.9752，=0.9504，说明该模型与实验拟合良好，自变量与响应值之间线性关系显著，可以用于此反应的理论推测。

由F值可以得到因子贡献率为:X3＞X2＞X1＞X4，即:超声时间＞料液比＞乙醇浓度＞超声功率。各因素中X1，X2，X3，X4，X1X3，X2X3，X3X4，，，，达到了显著水平(P＜0.0500)。其中，乙醇浓度同超声时间，料液比同超声时间，超声时间同超声功率存在着交互作用，交互作用的3D曲面如图1，2，3所示，其中图1为乙醇浓度同超声时间交互作用的影响，图2为料液比同超声时间交互作用的影响，图3为超声时间同超声功率交互作用的影响。

分析此回归模型，得出提取凤丹籽总黄酮的最佳工艺条件为:乙醇浓度75%，料液比1∶21 g/mL，超声时间49 min，超声功率240 w，在此条件下凤丹籽总黄酮的提取率的预存值是9.005 mg/g。为检验响应面优化结果的可靠性，采用上述工艺条件对凤丹籽总黄酮进行提取，实际测得的平均得率为9.015 mg/g，其相对误差为0.11%，小于1%，因此该优化提取工艺参数准确可靠。

3 结论

采用超声辅助溶剂法提取凤丹籽中总黄酮，乙醇浓度、料液比、超声时间和超声功率均对总黄酮的提取有影响。其中，超声时间对凤丹籽总黄酮提取的影响最为显著，超声时间和乙醇浓度，超声时间和料液比，超声时间和超声功率之间的交互作用也存在一定的显著性。最佳工艺条件为:乙醇浓度75%，料液比1∶21 g/mL，超声时间49 min，超声功率240 w，此条件下，凤丹籽总黄酮的平均提取率为9.015 mg/g。

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Ultrasonic-assisted Extraction Technology of Total Flavonoids from Paeonia ostii T.Hong et J.X.Zhang seed

WU You1，LI Mei-qing1*，SUN Qiang1，CHEN Jian1，WU Ji-hua2，WANG Fen21College of Tea＆Food Science＆Technology，Anhui Agricultural University，Hefei 230036，China;2Anhui Branch of Beijing Tongrentang TCM Co.，Tongling 244000，China

Extraction conditions of total flavonoids from Paeonia ostii T.Hong et J.X.Zhang seed with ethanol combining ultrasonic were studied.Through single factor and Box-Behnken response surface analytical method，the scope and combination of influencing factor on extraction yield of total flavonoids were confirmed.The response surface methodology was employed to evaluate the effects of alcohol concentration，solid to liquid ratio，ultrasonic extraction time，ultrasonic power and their interaction.Results showed that extraction time on the extraction yield of total flavonoids had a significant effect.The optimum conditions of flavonoid extraction were as follows:alcohol concentration 75%，Solid to liquid ratio 1∶21 g/mL，ultrasonic extraction time 49 min and ultrasonic power 240 w，in this condition，the extraction yield of total flavonoids was 9.015 mg/g.

Paeonia ostii T.Hong et J.X.Zhang seed;total flavonoids;UV-spectrophotometry;ultrasonic-assisted;Box-Behnken response surface analytical method

1001-6880(2012)10-1454-05

2011-12-31 接受日期:2012-04-18

铜陵市科技局项目(2010GY14)

*通讯作者 E-mail:lmq@ahau.edu.cn

S567.1+5

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